妊娠期高血压的环形RNA测序及分析

王红琳,陈亚萍

(复旦大学附属上海市第五人民医院妇产科,上海 200240;*通讯作者,E-mail:honglin.wang@163.com)

妊娠期高血压是女性在妊娠期易发的一种妊娠期并发症。统计数据显示,妊娠期高血压在我国的发病率为9.4%[1],是主要的妊娠期并发症,容易造成患者子痫、抽搐、昏迷等症状,严重威胁了母婴健康,但其发病机制目前尚不明确[2-5]。因此,研究妊娠期高血压的发病机制,发现早期诊断和治疗的方法,具有重要的临床意义。一般认为,高血压的发病受到环境因素和遗传因素等多重因素的影响,有研究表明,表观遗传学在高血压发病过程中起到了非常重要的作用[6-10]。表观遗传学机制包括:组蛋白修饰、DNA甲基化、及非编码RNA。环状RNA(circRNA)作为一种新型的非编码RNA,广泛存在于动植物细胞中,作为microRNAs海绵、RNA结合蛋白螯合剂以及核转录调控因子发挥作用[11-13],参与调控基因表达[14,15]。根据文献报道,circRNA参与多种疾病的发生发展[16-19],但目前对于circRNA在妊娠期高血压疾病中的作用知之甚少。本研究中通过使用circRNA芯片技术研究妊娠高血压患者以及正常对照者血浆中circRNA的差异表达,初步建立妊娠高血压患者血浆circRNA的表达谱,然后扩大样本量,在妊娠高血压患者与正常对照组中对差异表达的circRNAs进行RT-qPCR验证,为研究circRNA在妊娠期高血压发生发展中所扮演的角色奠定理论基础。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选择2016-06～2018-06在我院分娩的妊娠期高血压疾病产妇,符合《妇产科学》诊断标准[20]。选取重度子痫前期和轻度子痫前期孕妇各33例作为观察组,选取33例正常孕妇作为对照组。每组随机选取3例对其血样本中circRNA行芯片筛选并对照分析,其余标本用于RT-qPCR验证。按以下标准筛选标准:①轻度子痫前期组:收缩压≥140 mmHg或舒张压≥90 mmHg,24 h蛋白尿≥300 mg,定性1+;②重度子痫前期组:收缩压≥160 mmHg或舒张压≥110 mmHg,24 h蛋白尿≥5.0 g,定性3+。排除心、肝、肾脏疾病以及糖尿病、双胎、肿瘤、出血性疾病以及其他血栓疾病史的患者。所有孕妇年龄20-35岁,平均(28.3±3.6)岁;孕周为(37±2.4)周。

1.2 研究方法

1.2.1 RNA提取检测及circRNA芯片筛选 使用适用于EVs内RNA提取的商品化试剂盒从患者血样本中提取总RNA,并对RNA的量和质量进行评估;根据Arraystar Super RNA Labeling(Arraystar,Inc.)试剂盒操作说明书,将总RNA采用随机引物扩增、反转录为荧光标记的cRNA;荧光标记的cRNAs在Arraystar circRNA Array上杂交,随后在Agilent Hybridization Oven上65 ℃孵育17 h;洗片后,在Axon GenePix 4000B扫描仪上扫描。

RNA的抽提与纯化:采用PAXgene Blood miRNA Kit(Cat#763134,QIAGEN,GmBH,Germany)并且根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的总RNA抽提,抽提所得总RNA经Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)电泳质检合格后备用。

RNA质检说明:芯片实验起始样本为总RNA,总RNA经NanoDrop ND-2000分光光度计及Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)进行质检,质检合格的RNA可进行后续的芯片实验。

RNA的放大和标记:实验样品RNA采用Agilent表达谱芯片配套试剂盒,Low Input Quick Amp WT Labeling Kit(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)和标准操作流程对样品总RNA进行放大和标记,并用RNeasy mini kit(QIAGEN,GmBH,Germany)纯化标记后的cRNA。

芯片杂交:按照Agilent表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒,Gene Expression Hybridization Kit(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US),在滚动杂交炉Hybridization Oven(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)中65 ℃,10 r/min,滚动杂交17 h,杂交cRNA上样量1.65 μg,并在洗缸staining dishes(Thermo Shandon,Waltham,MA,US)中洗片,洗片所用的试剂为Gene Expression Wash Buffer Kit(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)。

芯片扫描:完成杂交的芯片采用Agilent Microarray Scanner(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)进行扫描,软件设置Dye channel:Green,Scan resolution=3 μm,PMT 100%,20 bit。用Feature Extraction software 10.7(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)读取数据,最后采用R软件中limma包进行归一化处理,所用的算法为Quantile。筛选差异基因的标准是fold change≥2或fold change≤0.5。

1.2.2 逆转录cDNA的合成 在Microtube管中加入2 μg的RNA,1 μl的Primer Mix,用RNase-free water补足体积至15 μl。在70 ℃保温5 min,然后迅速置于冰上5 min。离心数秒使上述溶液聚集于管底部,加入5 μl的5×buffer,2 mmol/L dNTPs 6.25 μl,M-MLV1μl,RNase-free water 12.75 μl,42 ℃保温60 min,即可获得cDNA。

1.2.3 PCR扩增反应验证差异表达的circRNAs 从芯片检测结果中差异表达的circRNAs中根据差异显著性和通路两方面选取4个circRNAs进行验证。

配制PCR反应液:2 mmol/L dNTPs 4 μl、前引物1 μl、后引物1 μl、MgSO40.8 μl、C3H8O32 μl、10×KOD buffer 2 μl,体积总量为20 μl,PCR扩增引物见表1。

表1 PCR扩增引物序列

Table 1 Primer sequences for the PCR amplification

基因名称 引物序列(5′-3′) hsa-circ-0039342F:TTCAACTCCTTCCGCCTCCGR:CAGCTGCCATGTACGTGCTG hsa-circ-0054441F:AAACGTTATTGTGCCAAATGTACTGTR:TCGGGAGCGCTGAATCTGAA hsa-circ-0003171F:ACCTCAGCTAGTGACGTATGGAR:TCTCTCACGCTGTCCGAAGT hsa-circ-0085752F:AATCCAGCTTTGGCGGTTGCR:GGTCAAGGTAAGCAGCTGCC GAPDHF:CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTCR:ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC

反应条件:热变性94 ℃ 5 min,变性94 ℃ 20 s,退火60 ℃ 30 s,延伸68 ℃ 30 s,循环35-45次,最后延伸68 ℃ 10 min。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线。

1.3 统计学分析

运用统计学软件SPSS17.0对circRNAs内参基因表达量进行统计学分析,对所获得数据进行正态分布检验,如若符合正态分布就采用t检验,否则采用秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA质检结果

用于芯片检测的三组共9个样品的RNA都进行了严格的质检,进行高通量检测的RNA质量合格,AI表示RNA质量合格。结果见表2。

表2 RNA质检结果

Table 2 Results of the RNA test

分组样品浓度(μg/μl)体积(μl)总量(μg)A260/A280RIN28S/18S结果正常组1260.47519.532.147.71.0A12194.57514.592.178.41.4AI3227.97517.092.158.31.3AI轻度子痫前期组1107.3758.052.187.81.1AI2262.97519.722.107.00.7AI3168.37512.622.177.91.1AI重度子痫前期组1117758.782.197.40.7AI2132.1759.912.188.61.4AI3139.77510.482.178.41.2AI

2.2 统计学结果分析

circRNA芯片一共检测到超过88 000个表达的circRNA,其中在轻度子痫前期-正常样本组、重度子痫前期-正常样本组、重度子痫前期-轻度子痫前期组样本组间分别有1 075(其中上调279,下调796)、1 747(其中上调396,下调1351)、1 426(其中上调428,下调998)个circRNA表达差异(见表3、图1)。轻度子痫前期和重度子痫前期与正常样本有316个共同的差异circRNA,这些circRNA很可能与妊娠期高血压的发生有关。

表3 各组间样本差异表达circRNA(个)

Table 3 Differentially expressed circRNA between different groups(numbers)

组别 差异表达基因下调基因上调基因轻度子痫前期与正常组1075796279重度子痫前期与正常组17471351396重度子痫前期与轻度子痫前期1426998428

2.3 生物信息学结果分析

对芯片检测的差异circRNA的亲本基因做KEGG富集分析,三个比较组的下调基因富集在“黏着斑通路”(P<2.66×10-5,P<2.78×10-9,P<1.36×10-7)(见图2);重度子痫前期-正常组、重度子痫前期-轻度子痫前期组下调的基因富集在“HPV感染通路”(P<3.46×10-7,P<3.08×10-5)。GO通路分析显示hsa-circ-0039342(ADCY7),hsa-circ-0003171(PTK2),hsa-circ-0085752(PTK2)的亲本基因都作用于“钙信号通路”,“趋化因子信号通路”和“GnRH信号通路”,并且这3个circRNA都是下调的。

2.4 实时定量PCR法验证差异表达的circRNA

从芯片检测结果中差异表达的circRNAs中根据差异显著性和通路两方面来选取4个circRNAs进行验证,验证结果显示有3个circRNAs表达下调,有1个circRNA表达上调。与circRNA测序结果一致。每个样品的上样量都是2 μl,结果见表4。

红色表示fold change>2,绿色代表fold change<0.5图1 circRNA表达分布图Figure 1 The distributions of the circRNA expressions in different groups

A.轻度子痫前期vs正常组 B.重度子痫前期组vs正常组 C.重度子痫前期组vs轻度子痫前期组图2 circRNA亲本基因在通路上富集情况Figure 2 The significant enrichment of the parental genes of differentially expressed circRNA

表4 实时定量PCR法验证差异表达的circRNAs

Table 4 The fold changes of differentially expressed circRNAs by real-time quantitative PCR

circRNA编号表达的差异倍数上调/下调宿主基因hsa-circ-00393420.003092085下调ADCY7hsa-circ-00544413.297850772上调PRKCEhsa-circ-00031710.043062584下调PTK2hsa-circ-00857520.173169147下调PTK2

3 讨论

circRNA在妊娠期高血压发生发展过程中发挥了内源性竞争的作用,即病程的加重与circRNA的下调存在一定的相关性。本研究中轻度子痫前期组与正常组相比,重度子痫前期组与轻度子痫前期组相比,circRNA都是呈现上调趋势,通过对下调circRNA进行KEGG通路分析,我们发现,下调circRNA的亲本基因都显著富集在黏着斑通路上,说明该通路可能与妊娠期高血压的疾病发生和病程发展密切相关。Heimrath等[21]研究表明,在子痫前期的发生中,黏附分子在活化内皮细胞上的表达增强了炎症过程,并进一步导致内皮损伤。一些激活和损伤内皮细胞的因素可能具有重要意义。

选取不同病程的妊娠期高血压患者,通过进行差异性基因及通路分析发现,HPV通路和妊娠期高血压有着极显著的关联性。检索相关文献,温海燕等[22]收集了102例子痫前期和对照病人,比较了两组病人的HPV感染情况，发现高危型HPV感染阳性的孕妇和子痫有着显著的正相关性(r=0.572,P=0.014),徐文等[23]用Meta分析的方法,收集了2017年12月19日前相关的12篇公开发表的文献,统计分析高危型HPV病毒是否会导致不良的妊娠结局,同时分析了对子痫前期的影响,结果也证实了有统计相关性。本课题研究结果中,重度组与轻度子痫前期及正常组的KEGG信号通路分析显示:差异circRNA的亲本基因显著富集在HPV感染相关的通路上,妊娠期高血压患者可能与HPV感染存在强烈的相关性,这与之前的文献研究是相符的[22]。也提示着我们可以进一步研究探讨其分子机制。

因此,本文通过对妊娠期高血压患者血样标本进行生物芯片的检测和分析,得出结论:circRNA(hsa-circ-0039342、hsa-circ-0054441、hsa-circ-0003171和hsa-circ-0085752)在妊娠期高血压病程发展中起着重要作用,而且妊娠期高血压发病可能与HPV的感染及黏着斑通路相关。当然,本次的临床试验数据还不足以判断circRNA的表达情况同妊娠期高血压之间关系存在的规律和机制,但是,对于妊娠期高血压的病程发生以及临床上的预防和治疗研究有一定的参考价值。