在高胆红素血症新生大鼠海马区碱性成纤维细胞生长因子的表达

王 娟,阴怀清,程 皓,史瑞玲

(1山西医科大学第一临床医学院小儿内科,太原 030001;2山西医科大学第一医院儿科;*通讯作者,E-mail:yhq0351@163.com)

新生儿时期最常见的临床问题之一是黄疸,2016年,每10万活产婴儿死亡中有1 309例诊断为该病,在所有新生儿死亡原因中排名全球第七[1]。有些婴儿由于缺乏适当的监测和合理的治疗,使得过量的血清胆红素浓度侵及脑组织而引起胆红素脑病[2]。但是,高胆红素血症脑损伤的病理生理机制尚不清楚。近年研究表明,各种病理脑损伤时,损伤区域bFGF表达上调,通过抑制细胞凋亡、保护星形胶质细胞不受损伤、促进神经干细胞/祖细胞增殖和分化等发挥神经保护作用。本实验建立了高胆红素血症小鼠模型,通过测定海马区凋亡指数与bFGF的阳性表达细胞灰度值,观察细胞凋亡与bFGF表达的关系及bFGF与胆红素脑损伤的关系,探索bFGF的作用与机制,为防治胆红素脑病及临床诊治提供动物实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

7日龄(Sprague-Dawley)SD大鼠120只,清洁级,生产许可证号SCXK(晋)2015-0001,购买于山西医科大学动物实验中心,体质量(12.70±1.14)g,雌雄皆用,随机分为3组:对照组(对照组腹腔注射0.9% NaCl),高胆红素血症组(T1组,腹腔注射胆红素100 μg/g),高胆红素血症组(T2组,腹腔注射胆红素150 μg/g)。按照实验要求药物注射6,12,24,48,72 h分别选取8只将其处死,从而把每组分为5个亚组。

1.2 主要试剂

胆红素购买于美国MCE公司,一抗(FGF2 Polyclonal Antibody-A0235)购买于武汉ABclonal公司,二抗(兔IgG-SA1022)、TUNEL试剂盒-POD(MK1020)均购买于博士德生物技术公司;3%H2O2溶液、蒸馏水、柠檬酸修复液、PBS缓冲液、DAB显色试剂、苏木素等由山西医科大学第一医院病理科提供。

1.3 配制胆红素

在黑暗环境下精细称取胆红素30 mg,溶于1 ml 0.5 mol/L NaOH中,加入9 ml双蒸水,用浓度为0.5 mol/L的HCl滴定,直至pH为8.5,浓度为3 g/L,将配好的溶液于1 h之内使用。

1.4 制作模型

参照文献[3]方法,对照组腹腔注射0.9% NaCl溶液,T1组和T2组仔鼠腹内分别注射胆红素100 μg/g和150 μg/g,药物注射后常规室温下由母鼠分别哺乳6,12,24,48,72 h。

1.5 观察健康情况和行为、制备标本

药物注射后仔细观察各组大鼠一般表现情况的区别,比如体质量增长情况、有无萎靡、抽搐、反应减弱、活动减少等。标本制备过程:于各时间点抓取大鼠,用5%水合氯醛麻醉,然后固定于手术台上,用分离器逐层解剖至肝脏、心脏暴露,在肝缘剪一小口,用皮试针针头小心刺入心脏搏动明显的地方,先后用20 ml生理盐水+20 ml甲醛灌洗,观察肝缘小口处流出液体由红色变清亮,使大鼠脑组织充分变白后停止灌注,并立即断头,仔细剥离出脑组织,快速浸泡于10%甲醛中放置24 h后送至病理科,于视交叉及其后4-5 mm处切除各组大鼠多余的脑组织,海马区充分包括在剩余脑组织内,从而形成实验组织,脱水后行石蜡包埋。

1.6 HE染色及免疫组织化学法

在老师的协助下将包埋好的石蜡包块连续切片并做HE染色,观察海马区细胞形态及结构变化;TUNEL法测细胞凋亡、免疫组化法测bFGF表达(选择HE邻近切片);以PBS缓冲液进行对照,其余步骤根据试剂盒说明书进行严格操作。

1.7 采集图像及数据

数字化组织切片扫描系统来自美国Aperio公司Scanscope CS仪器。对每张切片进行扫描,选取海马区附近4个视野(×400)采图。各视野内细胞总数及凋亡细胞个数被测定,求出凋亡率:凋亡细胞个数/细胞总数×100%,分析和计算平均值。测定海马区bFGF阳性表达细胞灰度值,计算和分析平均值,并计算其OD值:logA/B,A=240,B=灰度值。bFGF灰度值与bFGF表达负相关,OD值与bFGF表达正相关。

1.8 统计学分析

各组数据的统计学分析应用SPSS24.0软件。所有数据用均数±标准差表示。组间比较应用析因设计的方差分析,两两比较应用SNK-q检验,若方差不齐,则应用秩和检验。两个变量间的关系应用直线相关分析,P<0.05表示差异有统计学意义。确定α=0.05为检验标准。

2 结果

2.1 健康情况和行为

药物注射后6 h实验组大鼠开始发生行为变化,对照组无明显变化;24 h左右开始有萎靡、活动减少、反应减弱等表现,T2组比T1组表现明显;到72 h有的大鼠出现肌张力增高、抽搐、体质量增长欠佳等表现,T2组比T1组表现明显。

2.2 海马区HE染色

对照组海马区脑细胞形态正常,胞核饱满,核仁居中,各细胞整齐排列;T1组脑细胞较对照组减少,排列稍微紊乱,胞核部分消失,细胞水肿变性,部分可见空泡,并可见胶质细胞增生;T2组脑细胞排列紊乱,空泡变性明显,胞核溶解、碎裂、消失,胶质细胞增生更明显,镜下见T2组细胞受损比T1组严重(见图1)。

2.3 海马区细胞凋亡情况

对照组几乎没有或者仅有少数的细胞凋亡,而T1组和T2组于造模后6 h即可见凋亡小体出现,24 h凋亡数增加较明显,到72 h时凋亡数呈高峰,且同一时间点比较,T2组凋亡数比T1组更多、更明显,差异有统计学意义(P<0.05,见表1,图2)。

图1 新生大鼠各组海马区病理图片 (HE,×400)Figure 1 Pathological changes of hippocampal area of each newborn rat group (HE,×400)

表1 脑细胞在各时间点的凋亡情况(%)

Table 1 Apoptosis rate of brain cells at each time point(%)

组别6 h12 h24 h48 h72 h对照组1.001±0.0011.153±0.1961.154±0.1971.487±0.4692.319±0.482T1组1.606±0.421∗2.990±0.210∗3.990±0.210∗5.657±0.404∗7.709±0.522∗T2组3.703±0.331∗#4.422±0.405∗#5.755±0.241∗#8.755±0.241∗#10.411±0.507∗# F62.92697.466343.555270.554200.151 P0.0100.0000.0000.0010.000

与对照组比较,*P<0. 05;与 T1组比较,#P<0. 05

图2 新生大鼠各组各时间点海马区细胞凋亡情况(DAB,×400)Figure 2 Apoptosis of hippocampal cells in newborn rats at different time points(DAB,×400)

2.4 海马区bFGF表达情况

对照组bFGF少量表达;T1组和T2组6 h时bFGF表达开始出现,24 h表达增加较明显,到72 h表达呈高峰,且同一时间点比较,T2组阳性表达细胞比 B组更多、胞浆着色更明显,差异有统计学意义(P<0.05,见表2,图3)。

2.5 相关性分析

高胆红素血症新生大鼠海马区bFGF阳性表达细胞(OD值)与细胞凋亡率呈正相关(r=0.994,P<0.01)。

组别6 h12 h24 h48 h72 h对照组199.258±1.033198.574±0.633198.200±0.512197.162±0.491197.047±0.281T1组191.957±0.744∗188.707±0.709∗183.574±1.485∗178.240±2.050∗171.341±0.491∗T2组185.475±0.685∗#181.985±0.613∗#177.700±0.961∗#170.034±1.625∗#161.556±0.741∗# F204.504489.211295.499245.751347.118 P0.0050.0010.0000.0000.000

与对照组比较,*P<0.05;与T1组比较,#P<0.05

图3 新生大鼠不同时间点海马区bFGF的表达(DAB,×400)Figure 3 Expression of bFGF in hippocampal area of newborn rat at different time point (DAB,×400)

3 讨论

胆红素,特别是亲脂的未结合胆红素,它是一种对脑发育有重要影响的神经毒素,胆红素通过过度刺激NMDA受体(兴奋毒性)、降低细胞膜Na-K-ATP酶及Ca-ATP酶活性从而促进细胞凋亡;游离胆红素也会刺激胶质细胞增生及损害髓鞘生成等而对脑组织产生毒性作用,并对以后脑发育过程发生影响[4,5]。所以,近年来,新生儿胆红素脑病的危害也备受关注。

Silva等[6]的实验结果表明,游离胆红素诱导神经元产生亚硝酸盐和环状鸟苷一磷酸,从而诱发神经元氧化损害,而这个过程主要发生在海马神经元中;并且发现与皮质或小脑的神经元相比,暴露于胆红素后,海马神经元中活性氧含量最高,氧化损伤最严重,所以认为游离胆红素对脑组织的毒性作用在海马区有特殊易感性,因此本实验主要选取海马区为研究部位。研究发现[7],胆红素引起的脑细胞死亡方式主要是通过凋亡通路级联反应引起的细胞凋亡。本实验结果显示,对照组几乎没有细胞凋亡,而T1、T2组于造模后6 h即可见凋亡小体出现,24 h凋亡数增加较明显,到72 h凋亡数呈高峰,且同一时间点比较,T2组凋亡数比T1组更多、更明显,差异有统计学意义(P<0.05。说明随着胆红素进入脑组织的量的增加及时间的延长,脑细胞凋亡数增加,凋亡程度也增加,这与Watchko[8]的研究结果基本相近。同时也表明高胆红素血症神经毒理过程有细胞凋亡的参与。

既往研究表明,在多种原因导致脑组织缺氧缺血性损伤后损伤区bFGF及bFGF mRNA表达上调,从而对损伤周围的细胞起到保护作用[9,10]。但是关于胆红素诱导脑损伤后,脑组织bFGF的表达情况及其作用机制的研究少见。新的研究发现严重的胆红素血症可以导致星形胶质细胞激活及髓鞘损害,然而这些变化可能与严重的高胆红素血症后观察到的神经学后遗症有关[11]。同时Liu等[12]在体外模拟脑缺血的实验条件下发现,bFGF作用的原代星形胶质细胞中cav-1/VEGF表达上调,保护星形胶质细胞不受损伤,从而可能会防止严重高胆红素血症引起的神经后遗症。所以本实验选择研究bFGF在高胆红素血症脑损伤中的表达情况,试图探索其作用与机制。bFGF是由155个氨基酸构成的多肽,是一种细胞分裂原,主要来源于中胚层和神经外胚层,可刺激神经外胚层组织的有丝分裂,潜在地促进神经元存活和星形胶质细胞生长,诱导神经分化[13]。bFGF的N末端区域是结合肝素的重要部分,正是这一特性使其对热、酸度和蛋白酶更加稳定[14]。这也是决定其成为成纤维细胞生长因子家族中研究最早、应用最广泛的原因之一。本实验结果显示T1、T2组于6 h可见bFGF表达,24 h时表达增加较明显,72 h时表达呈高峰,与研究[15]结果基本一致。海马区细胞凋亡率与bFGF阳性表达细胞(OD值)呈现出正相关(P<0.01),所以认为胆红素进入脑组织后,通过细胞凋亡的方式诱导脑损伤,损伤细胞释放出bFGF,可能对周围神经起到营养、支持、保护作用。同时也有研究发现[16,17],bFGF通过激活PI3 K/Akt/ERK1/2途径减轻心肌缺血再灌注时内质网应激和线粒体损伤而达到抑制细胞凋亡的作用;bFGF也可以通过调节Bcl-2和Bax的表达水平,使Bcl-2表达增加,Bax表达减少,从而抑制N-甲基-D-天冬氨酸诱导大鼠视网膜神经节细胞层的细胞凋亡,达到保护作用。因此推测胆红素诱导脑损伤后,bFGF可能通过抑制细胞凋亡而发挥神经保护作用,但这需要外源性给予bFGF以探索其作用机制,在之后的实验中已经完善。此外,研究表明,FGF2参与调控海马齿状回下区的神经干细胞/祖细胞发育,促进神经元数量增加,促使细胞增殖,还可以诱导轴突和树突分支点更多,而起到神经保护作用[18,19]。

综上所述,高胆红素血症脑损伤时,海马区有bFGF的释放,bFGF的表达与细胞凋亡有着紧密联系,可能参与了其病理生理过程而发挥重要的神经保护作用。