氧化低密度脂蛋白通过氧化应激介导的MKKs/p38信号通路诱导巨噬细胞炎症反应

闵宁斌,张少华,刘仲伟,项 羽*

(1陕西省人民医院心血管内科,西安 710000;2陕西省合阳县人民医院心内科;*通讯作者,E-mail:yqbohx@sina.com)

动脉粥样硬化是包括中风及冠心病等在内的心血管疾病的共同发病机制。动脉粥样硬化可以被视为动脉壁的慢性炎症,多种细胞参与了该炎症过程[1]。巨噬细胞是动脉粥样硬化病变中一种重要的免疫细胞,在动脉粥样硬化的发生发展及斑块演变中扮演重要的角色[2]。巨噬细胞的炎症反应可导致病变局部炎症瀑布的激活,进而参与泡沫细胞形成、血小板聚集、血栓形成及斑块破裂等粥样硬化特征性病理改变[3]。目前公认氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是动脉粥样硬化的始动及促进因子。研究表明ox-LDL能够通过激活斑块内巨噬细胞炎症反应使斑块的不稳定性增加[4]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是一组结构内包含p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶及细胞外调控结构的蛋白激酶家族。p38 MAPK信号通路可被不良刺激如活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)激活并介导炎症反应[5]。我们的既往研究及其他文献表明,p38 MAPK的激活有赖于其上游的MAPK激酶3(MKK3)及MKK6的激活[6,7]。综上所述,我们提出ox-LDL可能通过增加巨噬细胞内ROS的异常产生而诱导MKKs/p38 MAPK信号通路激活,进而诱导巨噬细胞内炎症反应发生的科学假说。本研究将以ox-LDL刺激的巨噬细胞为研究对象,采用分子生物学的方法对该科学假说进行验证。本研究的结果不但会有益于对动脉粥样硬化发病机制的进一步认识,而且为动脉粥样硬化的治疗提供新的靶点与线索。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

RPMI-1640培养基(Hyclone,美国)、胎牛血清(Hyclone,美国)、ox-LDL(北京索莱宝科技有限公司)、SB203580(Merck,德国)、SignalSilence MKK3 siRNA(Cell Signaling Technology,美国)、SignalSilence MKK6 siRNA(Cell Signaling Technology,美国))、Mirus TransIT-TKO试剂盒(Mirus,美国)、RIPA缓冲液系统(Santa Cruz,美国)、DCFH-DA探针试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)、Quantkine human IL-18试剂盒(R&D,美国)、Quantkine human TNF-α试剂盒(R&D,美国)、T-AOC试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)、总蛋白抽提试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)、p-MKK3抗体(Sigma-Aldrich,美国),MKK3抗体(Sigma-Aldrich,美国),p-MKK6抗体(Sigma-Aldrich,美国),MKK6抗体(Sigma-Aldrich,美国),p-p38 MAPK抗体(Cell Signaling Technology,美国),p38 MAPK抗体(Cell Signaling Technology,美国),IL-18抗体(Abcam,美国)、TNF-α抗体(Abcam,美国)以及GAPDH抗体(Invitrogen,美国)。

1.2 细胞培养与处理

常规复苏人类巨噬细胞系THP-1(ATCC，美国)，接种于含10%胎牛血清(BSA)的RPMI-1640培养基，在5% CO2，饱和湿度及37 ℃条件下培养2-4代，取处于生长对数期的细胞进行后续实验。将细胞分为以下几组：①正常对照组(control)；②低浓度ox-LDL刺激组(L-LDL)：以终浓度为25 μg/ml的ox-LDL培养细胞48 h；③中浓度ox-LDL刺激组(M-LDL)：以终浓度为50 μg/ml的ox-LDL培养细胞48 h；④高浓度ox-LDL刺激组(H-LDL)：以终浓度为100 μg/ml的ox-LDL培养细胞48 h；⑤p38 MAPK抑制组(p38i)：以p38 MAPK抑制剂SB203580(终浓度10 μmol/L)预处理细胞48 h，再以终浓度为100 μg/ml的ox-LDL培养细胞48 h；⑥MKK3抑制组(MKK3i)：以终浓度为100 μg/ml的ox-LDL培养MKK3-siRNA转染的巨噬细胞48 h；⑦MKK6抑制组(MKK6i)：以终浓度为100 μg/ml的ox-LDL培养MKK6-siRNA转染的巨噬细胞48 h。

1.3 siRNA转染

使用RNA干扰(RNAi)技术对巨噬细胞内MKK3及MKK6进行沉默。该过程使用了商业化的RNAi试剂盒,即SignalSilence MKK3 siRNA及SignalSilence MKK6 siRNA。转染过程使用Mirus TransIT-TKO试剂盒对巨噬细胞进行48 h转染。操作过程均按照上述试剂盒说明书进行。

1.4 细胞内ROS检测

细胞内生成的ROS使用ROS DCFH-DA探针试剂盒以荧光染色的方法进行检测。磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗细胞后与DCFH-DA(10 μmol/L)在暗盒中37 ℃条件下共培养30 min。以倒置荧光显微镜在530 nm波长下对细胞进行观察并获取图像。以Image-Pro软件对图像荧光强度进行分析，该荧光强度代表细胞内ROS水平。

1.5 抗氧化能力检测

以RIPA缓冲液系统对巨噬细胞进行裂解并制备细胞匀浆。4 ℃下对匀浆进行5 min的12 000g高速离心。使用T-AOC试剂盒对上清液标本中总抗氧化力(TAC)进行检测。酶标仪在734 nm读取ABTS+的吸光度值代表TAC。操作均按照试剂盒说明书进行。

1.6 细胞培养上清液炎症因子水平检测

将细胞离心后获得细胞培养上清液,经过Centricon-YM10浓缩柱处理后,分别使用Quantkine human IL-18 ELISA试剂盒及Quantkine human TNF-α ELISA试剂盒对标本中IL-18及TNF-α浓度进行检测。操作均按照试剂盒说明书进行。

1.7 蛋白免疫印迹法检测蛋白磷酸化及表达水平

以RIPA缓冲液系统对巨噬细胞进行裂解,使用总蛋白抽提试剂盒提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。蛋白煮沸变性后,以垂直SDS-PAGE分离蛋白标本。电转印法将分离的蛋白转移至PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭后,分别以p-MKK3(1 ∶4 000),MKK3(1 ∶4 000),p-MKK6(1 ∶2 000),MKK6(1 ∶2 000),p-p38 MAPK(1 ∶4 000),p38 MAPK(1 ∶4 000),IL-18(1 ∶4 000)以及TNF-α(1 ∶4 000)抗体在4 ℃下对上述PVDF膜孵育8 h。TBST充分漂洗后使用相应二抗室温下对PVDF膜孵育2 h。ECL法对蛋白印迹条带进行显影。

1.8 统计学分析

所得数据采用均数±标准差表示,录入SPSS(ver16.0)并进行分析。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ox-LDL刺激增加巨噬细胞内氧化应激水平

DCFH-DA荧光染色显示,与control组相比,L-LDL、M-LDL以及H-LDL组细胞内ROS水平均显著升高,且具有浓度依赖性(P<0.05);同时细胞内TAC水平均显著下降,具有浓度依赖性(P<0.05,见图1,2)。

图1 细胞DCFH-DA荧光染色及荧光强度检测 (n=3,×400)Figure 1 DCFH-DA fluorescent stain of macrophages in different groups (n=3,×400)

2.2 ox-LDL刺激诱导巨噬细胞内炎症反应

ELISA法及蛋白免疫印迹法结果均表明,与control组相比,L-LDL、M-LDL以及H-LDL组细胞培养上清液及细胞内IL-18及TNF-α水平均显著升高,且具有浓度依赖性(P<0.05,见图3,4)。

2.3 ox-LDL刺激激活巨噬细胞内MKKs/p38 MAPK

与control组相比,L-LDL,M-LDL以及H-LDL组细胞内MKK3、MKK6以及p38 MAPK磷酸化水平显著升高,具有ox-LDL的浓度依赖性(P<0.05,见图5)。

与control组相比,aP<0.05;与L-LDL组相比,bP<0.05;与M-LDL组相比,cP<0.05图2 细胞内总抗氧化能力(TAC)水平比较 (n=3)Figure 2 Comparisons of TAC among different groups (n=3)

与control组相比,aP<0.05;与L-LDL组相比,bP<0.05;与M-LDL组相比,cP<0.05图3 细胞培养上清液炎症因子浓度比较 (n=3)Figure 3 Comparison of inflammatory cytokine concentrations in medium supernatant among different groups (n=3)

与control组相比,aP<0.05;与L-LDL组相比,bP<0.05;与M-LDL组相比,cP<0.05图4 巨噬细胞内IL-18及TNF-α蛋白及相对表达水平比较 (n=3)Figure 4 Comparison of protein expression of IL-18 and TNF-α in macrophages among different groups (n=3)

与control组相比,aP<0.05;与L-LDL组相比,bP<0.05;与M-LDL组相比,cP<0.05图5 巨噬细胞内p-MKK3、MKK3、p-MKK6、MKK6、p-p38、p38及GAPDH蛋白表达及磷酸化水平比较 (n=3)Figure 5 Comparison of protein expression of p-MKK3, MKK3, p-MKK6, MKK6, p-p38, p38 and relative phosphorylation levels in macrophages among different groups (n=3)

2.4 抑制MKKs/p38 MAPK信号通路对巨噬细胞内氧化应激水平无显著影响

与H-LDL组相比,p38 MAPKi组、MKK3i组以及MKK6i组细胞内ROS水平以及TAC水平之间的差异无统计学意义(P>0.05,见图6,7)。

图6 抑制MKKs/p38 MAPK信号通路后细胞内总抗氧化能力(TAC)水平 (n=3)Figure 6 Changes of TAC after inhibition of MKKs/p38 MAPK signaling pathyway (n=3)

图7 抑制MKKs/p38 MAPK信号通路后细胞DCFH-DA荧光染色及荧光强度变化 (n=3,×400)Figure 7 DCFH-DA fluorescent stain and fluorescence intensities in macrophages after inhibition of MKKs/p38 MAPK signaling pathyway (n=3,×400)

2.5 抑制MKKs/p38 MAPK信号通路减轻巨噬细胞内炎症反应

p38 MAPK特异性抑制剂对其磷酸化起到显著抑制的效果;MKK3-siRNA及MKK6-siRNA分别显著抑制了MKK3及MKK6的磷酸化水平。此外,与H-LDL组相比,p38 MAPKi组、MKK3i组以及MKK6i组细胞培养上清液及细胞内IL-18及TNF-α水平均显著降低,且均具有统计学意义(P<0.05,见图8-10)。

图8 抑制MKKs/p38 MAPK信号通路后巨噬细胞内p-MKK3、MKK3、p-MKK6、MKK6、p-p38、p38及GAPDH蛋白表达及磷酸化水平变化 (n=3)Figure 8 Changes of protein expression of p-MKK3, MKK3, p-MKK6, MKK6, p-p38, p38 and relative phosphorylation levels in macrophages after inhibition of MKKs/p38 MAPK signaling pathyway (n=3)

3 讨论

心血管系统疾病目前病死率世界排名第一,远远高于恶性肿瘤及感染性疾病等。动脉粥样硬化是心血管疾病的特征性病理改变,其发生发展的机制非常复杂。LDL在动脉粥样硬化的发病各个阶段均扮演重要的角色[8]。高脂血症时,LDL在动脉壁聚集,进入动脉血管中膜层,接受氧化修饰。生成的ox-LDL可募集血液循环中的单个核细胞,在动脉中膜层分化为巨噬细胞[9]。动脉粥样硬化可被视为一种炎症性疾病,许多免疫细胞参与其免疫炎症反应。例如动脉粥样硬化斑块脂质核心中浸润的大量中性粒细胞与斑块的易损性增加有关[10]。斑块周围的CD4+T淋巴细胞可在ox-LDL的刺激下产生免疫应答,分泌炎性细胞因子,从而参与并加重血管壁局部炎症反应[11]。既往研究表明,在动脉粥样硬化斑块中存在大量处于激活状态的巨噬细胞,可通过分泌细胞因子参与血管壁的局部炎症反应[2]。这些炎性细胞因子可进一步募集血液循环中的免疫细胞,诱发炎症反应。本研究结果表明,ox-LDL可诱导巨噬细胞产生明显的炎症反应,表现为细胞内及其分泌炎性细胞因子TNF-α及IL-18水平均显著升高。

图9 抑制MKKs/p38 MAPK信号通路后巨噬细胞内IL-18及TNF-α蛋白表达及变化Figure 9 Changes of protein expression of IL-18 and TNF-α in macrophages after inhibition of MKKs/p38 MAPK signaling pathyway

与H-LDL组相比,aP<0.05图10 抑制MKKs/p38 MAPK信号通路后细胞培养上清液炎症因子浓度变化 (n=3)Figure 10 Changes of inflammatory cytokine concentrations in medium supernatant after inhibition of MKKs/p38 MAPK signaling pathyway (n=3)

正常生理状态下,细胞内的抗氧化系统维持着胞内的氧化-抗氧化平衡。当细胞遭遇例如ox-LDL等病理因子的刺激时,细胞内氧化-抗氧化平衡被破坏,细胞内可产生大量的ROS,表现出多种细胞毒效应[12]。本研究结果表明,ox-LDL使巨噬细胞内TAC水平显著降低,同时ROS水平显著升高。表明ox-LDL的暴露使巨噬细胞抗氧化能力显著受损,氧化应激水平加剧。既往研究报道,在多种类型细胞内,p38 MAPK信号通路的激活可使胞内炎性细胞因子水平升高,进而诱发细胞炎症反应[13]。根据我们及其他研究者的既往研究,p38 MAPK的激活依赖于其上游激酶MKKs(MKK3及MKK6)对其的磷酸化[6,7]。同时,ROS可诱导MKKs产生磷酸化而激活[14]。本研究结果表明,ox-LDL可诱导巨噬细胞内MKK3、MKK6以及p38 MAPK磷酸化水平增加,说明ox-LDL能够诱导巨噬细胞内MKKs/p38 MAPK信号通路激活。

为了进一步研究MKKs/p38 MAPK信号通路的作用,本研究使用了特异性抑制剂对p38 MAPK的激活进行抑制,以RNAi对MKK3/6的表达沉默。结果表明,MKKs及p38 MAPK的抑制对ox-LDL诱导的巨噬细胞氧化应激无显著影响,但对其下游的炎症反应起到明显的抑制作用,此结果说明ROS是MKKs/p38信号通路激活的使动因子,也证实该信号通路激活可上调IL-18及TNF-α的表达。根据以上的研究结果,可得出以下结论:ox-LDL能够诱导巨噬细胞内发生氧化应激,产生大量ROS。后者能够诱导MKKs/p38 MAPK信号通路激活,进而诱发巨噬细胞炎症反应的发生。综上所述,MKKs/p38 MAPK信号通路可通过诱导巨噬细胞炎症反应参与动脉粥样硬化的发生发展;该通路可成为治疗动脉粥样硬化的潜在干预靶点之一。