鸡球虫耐药性研究进展

郝振凯，毕菲菲，韩贞艳，于咏兰，索 勋，刘贤勇

(中国农业大学动物医学院，北京海淀100193)

鸡球虫病是由球虫感染引起的消化道疾病，对全世界的养禽业带来巨大经济损失。球虫为顶复门、艾美耳属的细胞内寄生虫，能够感染鸡的球虫有7种，包括堆型艾美耳球虫(Eimeriaacervulina)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、早熟艾美耳球虫(E.praecox)和柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)[1]。它们在肠道的不同部位进行繁殖，破坏肠上皮细胞，引起消化吸收功能障碍，导致饲料转化率降低、鸡只生长迟缓等，严重时会造成雏鸡大规模死亡。

抗球虫药物自使用以来，有效的降低了由球虫病造成的经济损失，在养鸡集约化和规模化发展过程中起到了十分重要的作用[2]。但由于抗球虫药物的长期使用，导致针对不同抗球虫药物的耐药性球虫的出现，从而引起了越来越严重的抗球虫药物耐药性问题。据文献公开报道，所有已大规模使用的抗球虫药物均已出现相应的耐药虫株。

1 鸡球虫耐药性研究概况

目前广泛使用的抗球虫药物中，有些药物并不能杀死球虫而是抑制其在宿主体内的发育，一旦停止用药，球虫又能够继续发育繁殖；有的药物则对某些种类球虫的抑制作用或灭杀作用较差，例如巨型艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫对氨丙啉不敏感，正常浓度下仍可产生大量卵囊[3]。由于这些客观因素的存在，球虫耐药性的定义与其他物种耐药性定义之间存在些许差异。寄生虫学家Chapman认为球虫耐药性应该是指在正常可以杀死或抑制球虫繁殖的药物浓度下，某些虫株仍具有存活或繁殖能力的现象[4]。

从1954年首次确认了对磺胺喹恶啉耐药的虫株以来[5]，已有大量关于发现并证实耐药虫株的报道。到目前为止，所有投入使用的抗球虫药都已经发现了耐药虫株。尽管我国对球虫耐药性研究起步相对较晚，但在较短的时间内也发现了针对多种抗球虫药的耐药虫株(见中插彩版图1)。此外，随着研究的深入，研究者们还发现了具有多重耐药性的球虫，如对癸氧喹酯和氯羟吡啶多重耐药的堆型艾美耳球虫田间分离株[6]，甚至是对莫能菌素、马杜霉素、尼卡巴嗪、常山酮、氯苯胍、地克珠利都有完全耐药性的堆型艾美耳球虫分离株[7]。

2 鸡球虫耐药性检测方法

2.1 笼饲试验 鸡体试验是目前普遍使用的方法，结果也相对可靠。该方法是将药物拌入饲料或加入饮水中饲喂给鸡只，按照药物特性一段时间后接种球虫，通过相对卵囊产量(Relative oocyst production, ROP)、增重(Weight gain, WG)、病变积分减少率(Reduction of lesion scores, RLS)、最适抗球虫活性百分率(Percent of optimum anticoccidial activity, POAA)、抗球虫指数(Anticoccidial index ,ACI)、综合抗药指数(Global index, GI)等指标判断是否存在耐药性以及耐药程度[8]。虽然这种方法比较可靠，但试验耗时长，过程繁琐，影响因素较多，同时需要大量的实验动物和大量具有活力的卵囊等诸多限制因素。

2.2 细胞检测 为了快速检测球虫耐药性并避免鸡体检测的缺点，Strout等人创建了以柔嫩艾美耳球虫为模型的体外筛选抗球虫药物的方法。该方法以子孢子的入侵率为指标判断球虫对药物的敏感程度[9]。随后Zhu利用这种培养体系发现了莫能菌素敏感虫株和耐药虫株入侵能力的差异，同时发现了未能入侵细胞的敏感株子孢子在结构上发生了改变[10]。Jenkins等人在该模式的基础上通过定量PCR检测球虫特异性序列计算其入侵效率，进而建立了更加完善的体外检测方法[11]。近期Ahmed等人在前人的基础上建立了以繁殖抑制测试为指标的判定标准，通过这种方法测定聚醚离子载体类药物敏感性的结果与鸡体试验的GI结果高度一致[12]。体外检测与鸡体试验相比具有省时省力等优点，但目前这种方法仅使用于聚醚离子载体类药物，其他药物的试验结果相较于鸡体试验结果相差较大。

3 耐药虫株的实验室诱导

在发现田间出现球虫耐药虫株以后，研究者们就开始尝试在实验室诱导耐药虫株。目前主要有两种诱导方法：(1)由Weppleman等创建的一步法，是在使用药物推荐浓度下采用大剂量接种，只要排出足够多的卵囊即认为是具有耐药性的[13]。但使用这种方法诱导的耐药虫株需要大量的实验动物，同时有研究发现使用该方法获得的耐药虫株性状并不稳定，同时有些药物采用这种方法并不能诱导出耐药虫株[14-15]；(2)药物浓度递增法：是指先以低于推荐药物剂量开始诱导，然后逐渐提高药物剂量，经过多次传代获得耐药虫株。采用这种方法诱导的耐药虫株性状稳定，是当前普遍采用的诱导耐药虫株的方法。该方法的关键是确定起始药物浓度以及药物浓度梯度。常见的抗球虫均可采用这种方法诱导出相应的耐药性虫株(表1)。使用药物浓度递增法诱导耐药虫株传代次数并不固定，实验动物越多、接种数量越大，耐药虫株产生的速度也越快[16]。

表1 药物浓度递增法诱导常见药物的耐药性

E.a表示堆型艾美耳球虫；E.t表示柔嫩艾美耳球虫

4 常见抗球虫药物耐药机制研究

目前广泛使用的抗球虫药物种类很多，但按其化学结构和生产过程主要可分为聚醚离子载体药物和化学合成类药物。不同的药物都有其特定的作用机制，而耐药性的产生与其关系密切。

4.1 聚醚离子载体类药物 常见的聚醚离子载体类药物包括莫能菌素、盐霉素、马杜霉素、那拉霉素、拉沙里霉素等。这类药物是从不同的细菌培养物中提取的抗生素，在抑制球虫的同时具有促进生长的作用，是目前广泛使用的一类抗球虫药物。各类聚醚离子载体类药物具有相似的作用机制，能够扰乱子孢子或裂殖子内的阳离子浓度，进而破坏正常的渗透压，最终导致虫体内出现空泡并异常肿胀进而失去入侵宿主细胞的能力，主要作用于无性生殖阶段[25]。

聚醚离子载体类药物的敏感株与耐药株对该类药物的吸收具有明显的差异，柔嫩艾美耳球虫敏感株的子孢子对莫能菌素的吸收比耐药株的吸收要高出很多[26]。除此之外，敏感虫株与耐药虫株在转录水平上具有明显差异，主要包括能量代谢、蛋白转运、细胞骨架或细胞支架重排相关基因[27]。同时，差异蛋白的表达很有可能是耐药虫株出现的重要原因，Zhu等在莫能菌素耐药虫株的子孢子上发现了两种分子量大约在50.0 kDa和31.4 kDa的蛋白而在敏感株上没有发现[28]。近期通过蛋白质组学的研究表明，97种鉴定出来的蛋白中有25种存在差异，其中肌动蛋白在耐药虫株中明显上调表达而微线蛋白则显著下调表达[29]。从目前的研究成果来分析，该类药物耐药虫株的出现可能是由于虫体内的一系列的改变致使虫体细胞壁发生变化，降低了药物在虫体内聚集，使虫体可以正常转运阳离子进而使内部渗透压处于稳定状态。

4.2 磺胺类药物 磺胺类药物是最早发现并投入使用的抗球虫药，在很长一段时间内都作为最重要的治疗药物来使用，同时磺胺类药物第一个发现耐药虫株的药物。其作用机理是抑制二氢叶酸合成酶的活性，阻止二氢叶酸合成，进而干扰叶酸正常代谢，实现抑制球虫的目的，该类药物主要作用于球虫的裂殖生殖阶段[30]。

通过对乙胺嘧啶和磺胺邻二甲基嘧啶耐药虫株的研究发现，其耐药性的产生与二氢叶酸还原酶和二氢蝶酸合成酶编码基因的突变有关[31]。在弓形虫上的研究已经确认二氢叶酸还原酶的突变可以是乙胺嘧啶产生耐药性出现的原因，并且突变后的该基因已经作为药物筛选基因在转基因方面广泛使用[32-33]。因此，球虫对磺胺类药物产生耐药性的原因很可能是二氢叶酸还原酶和二氢蝶酸合成酶编码基因的突变，该突变导致了药物与酶的结合能力降低进而使虫体获得抗性。

4.3 癸氧喹酯 体外试验证实，癸氧喹酯可以阻断球虫线粒体内的电子转运过程，从而抑制球虫细胞呼吸作用，影响能量代谢[34]。而且在使用该药物的情况下，敏感虫株即使产生少量卵囊，其孢子化率也非常低，研究发现，该药物能够造成卵囊出现染色体异常联会的情况，这可能是卵囊不能正常孢子化的一个重要原因[35]。该药物主要作用于子孢子和第1代裂殖子生殖阶段，能够阻止子孢子入侵，并抑制裂殖子生殖。

Ryley等人发现低浓度的癸氧喹酯就具有很好的抗球虫作用，这表明球虫可能会从周围环境中吸收该药物并在体内聚集从而使虫体内的药物浓度升高[36]。Wang提出对该类药物耐药性的产生可能与虫体对药物的吸收和聚集作用减弱有关[34]。但通过对癸氧喹酯产生耐药性的疟原虫虫株的研究确认，其耐药性的出现与细胞色素B上的2个突变位点有关，尽管这一研究结果还没有在球虫上得到准确验证，但国内研究者已发现细胞色素B的基因突变会造成对该药物敏感性的降低[37-38]。因此该药物耐药性出现的主要原因很有可能是作为靶蛋白的细胞色素B编码基因突变，致使药物的结合能力降低，而是解除了药物对呼吸链电子转运过程的阻断。

4.4 氯羟吡啶 氯羟吡啶也是一种线粒体抑制剂类抗球虫药物，可以阻断线粒体呼吸链的电子转运，干扰能量代谢[5]。有研究表明，柔嫩艾美耳球虫的二代裂殖子和配子体对氯羟吡啶格外敏感，但并不会影响子孢子的入侵[39]。

但该药物的阻断位点与癸氧喹酯不同，将两种药物混合在一起使用，即使降低药物浓度也可以抑制线粒体的电子传递[40]。根据报道，这两种药物之间不存在交叉耐药性，并且当与癸氧喹酯联用时能更有效的抑制线粒体的电子转移过程。因此，这两种药物虽然能抑制线粒体的功能但具有不同的作用机制[41]。

4.5 氨丙啉 氨丙啉的化学结构与硫胺素相似，是硫胺素的拮抗剂。硫胺素在虫体内经过进一步反应生成硫胺素焦磷酸，在体内参与多种重要的碳水化合物代谢过程。而且氨丙啉比硫胺素更易被虫体吸收，因此该药物的使用可以减少虫体对硫胺素的吸收，进而干扰碳水化合物代谢[42-43]。该药物主要作用于裂殖子生殖阶段，因而被广泛用作治疗药物。尽管在田间已发现对该药物敏感性下降的虫株，但在实验室诱导该药物的耐药虫株却相对困难，因此目前对其耐药性的研究仍停留在临床检测阶段。

4.6 三嗪类 该类药物的代表为地克珠利和妥曲珠利。目前对该药物的作用机制尚未完全解析，但已发现其对有性生殖和无性生殖阶段均有抑制作用，因此可作为治疗药物和预防药物。有研究表明，这类药物可以通过抑制虫体细胞核分裂，进而抑制裂殖体发育；可以使虫体细胞的内质网发生膨胀，从而破坏虫体内细胞器的空间结构；可以抑制球虫呼吸过程中关键酶活性，阻断虫体内的呼吸作用，影响能量代谢[44-45]。

近期的研究主要在转录水平和蛋白质水平发现了该类药物对柔嫩艾美耳球虫体内蛋白表达的影响。国内研究者发现地克珠利对柔嫩艾美耳球虫的微线蛋白、乳酸脱氢酶、蛋白激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、热休克蛋白90、新型苏氨酸等蛋白的表达水平都具有调控作用[46-49]。通过转录组测序分析地克珠利耐药虫株与敏感虫株第二代裂殖子发现差异表达的基因有顶膜抗原-1、海藻糖-6-磷酸合酶1亚基、胸苷酸激酶假定蛋白等16个基因[50]。通过蛋白组学的研究发现，经地克珠利处理后有13种蛋白质的表达受到影响，但只能注释出其中11种蛋白的功能[51]。从目前的研究成果来看，该类药物很可能作用于多个靶基因，从而影响虫体内多种代谢通路，但其耐药性的产生机制目前仍未进行深入研究。

5 展望

由于球虫耐药性日益严重，田间分离获得的艾美耳球虫株已很难发现完全敏感的虫株。但由于受到检测方法的限制，导致球虫耐药性研究一直以来进展缓慢。尽管实验室诱导耐药虫株可以为其研究提供很好的素材，但它仍不能完全代替田间分离株。因此我们亟需找到一种快速、简单、准确的检测田间分离株的方法。

目前对抗球虫药物的作用机制和耐药性产生机制仍处于初步阶段，很多药物的作用机制是借鉴体外细胞试验和其他原虫的研究成果。随着分子生物学技术的发展，特别是球虫基因编辑技术的成熟，为解析抗球虫药物的作用机理、球虫耐药性产生机制和耐药基因的筛选提供了有效的技术支持。近年来基因组、转录组和蛋白质组学的普及，进一步促进了鸡球虫耐药性的研究。解析不同虫种的艾美耳球虫对不同种抗球虫药物的耐药性机制对指导合理用药，减缓耐药性的产生以及新的抗球虫药物的研发等都具有重要意义。