不同种属移植性肝癌动物模型的研究及建模策略

陈 思，黄小青，陈秀娟，杨 春，唐艳萍，李科志，曹 骥

(1.广西医科大学附属肿瘤医院，广西南宁530021；2.广西医科大学研究生学院，广西南宁530021；3.区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室，广西南宁530021)

肝癌(Liver cancer)通常是指发生于肝脏的癌症，如果由于肝脏内细胞所引发的癌症，称之为原发性肝癌，而由身体其他器官癌细胞转移至肝脏而形成的恶性肿瘤，称为继发性肝癌。原发性肝癌中85%属于肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)。作为死亡率较高的恶性肿瘤之一，其特点是进展迅速，治疗后易复发转移，据相关资料显示，近20年病死率呈逐年上升趋势。全球每年发病人数在60万以上，中国肝癌的发病率占全球50%以上[1-3]，据2017年美国癌症协会发表的统计数据，近25年美国癌症总死亡率降低了25%，但肝癌的死亡率仍保持上升趋势[4]，研究病因及有效的治疗措施迫在眉睫。然而到目前为止，HCC的致病机理、促癌致癌因素尚未明确，治疗及抑制转移效果尚不理想。动物模型是研究发病机制及临床药物试验的重要载体[5]，因此，建立接近与人体肝癌临床特征的动物模型对于明确病因及发病机制，发掘新的治疗方法具有重要意义。当前肝癌模型主要采用的动物包括小鼠、大鼠、裸鼠、仓鼠、兔、猪、鱼等，肿瘤的成因主要包括自发性、诱发性和移植性，本文主要探讨移植性肝癌模型。

1 肝癌模型的研究进展及应用

自发性肝癌是指实验动物未经人为因素干预，在完全自然状态下形成肿瘤组织；诱发性肝癌是通过化学、物理、生物等因素有目的作用于动物机体，通过损伤-纤维化-恶性转化过程引发癌肿[6]。以上两种肝癌模型均具有诱发周期长、起病具隐匿性、荷瘤动物个体差异大等特点，自发性肝癌模型的制备耗时长、成功率低，一般很少采用[7]，诱发性肝癌因为采用化学制剂致癌，具有一定的可控性，常用于病因机制、遗传学方面的研究，移植性肝癌是将来源于人或者动物的肝癌组织、细胞株或其他类型的恶性肿瘤移植入目的动物体内，弥补了肿瘤位置和大小的差异性不足，且移植存活率高，瘤体生长速度快，不仅可供于肝癌病因学的探索还可用于转移性机制及抑癌性的研究、抗癌药的筛选。

通过检索中国期刊全文数据库(表1)，自2016年1月至2017年9月共收录有关肝癌动物模型实验264例，其中采用诱发性动物模型50例，移植性214例。当前国内应用肝癌动物模型主要集中在新药的抗癌筛选、药效研究方面，占各类研究内容的74.0%，其次是动物模型构建方面的研究占比11.70%，采用小鼠作为肝癌模型的最多，比例为52.65%。

在种属的选择上主要依据试验的研究内容：小鼠、裸鼠和家兔主要是采用移植瘤株来构建模型。小鼠和裸鼠主要是异位移植，以腋窝和背部皮下为主，采用的瘤株多为H22小鼠肝癌细胞和HepG2人肝癌细胞。一般用来进行药物试验，特点是建模快捷、观察方便；家兔因为个体较其他模型偏大，容易通过外科手术直接将瘤株种植于肝脏，进行放射性治疗和影像学研究更有优势，主要采用VX2瘤株；大鼠和斑马鱼主要用于肝癌病因学的研究，以化学物质诱发肝细胞癌，大鼠常用Wistar、SD鼠研究致病机理，诱导剂一般采用二乙基亚硝胺(DEN)、黄曲霉素(AFB1)、四氯化碳(CCl4)二甲基氨基偶氮苯(3＇-Me-DAB)等，斑马鱼作为生物模型始于19世纪80年代，构建肝癌模型的优势在于其肝细胞功能接近于哺乳动物，如肝脏发育信号通路和相关因子、糖原和脂肪的储存、胆汁分泌、血清蛋白分泌等，并且与人类基因有87%的同源性[8]。但与哺乳类动物模型不同，斑马鱼难以开展移植性操作，多采用诱导性和转基因技术处理胚胎得到目的模型[9]。

表1 中国期刊全文数据库收录的不同种属肝癌动物模型试验统计 (2016年1月- 2017年9月)

注：部分试验同时进行了多位点移植或者双重目的性试验，裸鼠、大鼠和兔组别中均有1例试验同时移植了2个位点，裸鼠组中有2例试验包含两项研究内容

2 肿瘤移植位点

移植性肿瘤模型自建立30多年来，位点从最初的皮下移植逐渐发展至腹腔移植、原位移植、血液移植、淋巴移植等；移植的类型主要包括同种和异种移植两种[10]，当前有关肝癌动物模型移植位点的选择主要包括以下几种。

2.1 皮下移植 是各类模型最常用的位点，早期的移植材料来源为新鲜的人肝癌边缘组织，成功率较低只有11%左右，后来逐渐发展为应用细胞株，在HCC研究中，将人或动物的肝癌细胞株(或组织)种植于颈背部、腋下、后肢等部位的皮下，移植成功率分别为前肢腋下>躯干近头侧>背部>后肢，其中将人肝癌细胞种植到免疫功能缺陷的小鼠颈背部皮下，当移植的肿瘤细胞数为(1～5)×106时，成功率接近100%[11]。由该癌株增殖的肿瘤基本具有人肝癌细胞的特性，所得试验结果更有意义[12]。皮下移植不仅操作简单、观察测量方便，而且可以作为原位移植瘤的瘤源资源，但其缺点是缺乏肝癌细胞与肝脏组织之间的相互作用，在试验中有部分呈假阳性，而且如研究肝癌的远端转移选择该位点也不宜得到理想模型[11]。

2.2 原位移植 原位移植较皮下移植有较高的操作要求，但其优点在于保留了原有肿瘤组织的生物学特点和微环境，能更好地反应肝癌的侵袭能力和免疫逃逸机制[13]，而且腹腔浸润转移和腹水等生理现象也多见于此模型。原位移植模型的建立一般有两种途径，一种是将剪好的肿瘤组织(1×1×1 mm3)通过外科手术方法(开腹、穿刺)植入肝区[14]，当前也有很多模型是通过辅助设备进行肝瘤块的种植，例如经皮穿刺CT、DSA、MR影像引导制作兔VX2肝癌模型[15-16]；另一种是将细胞悬液直接注入肝左叶，而且在细胞数目(1～5)×106时，较易发生远端转移[17]。在先前的试验研究中，原位移植瘤的缺点在于只有将模型处死后才可进行瘤体组织的取出测量[18]，但当前有了影像学设备的辅助使得在体观察肿瘤生长、甚至新生血管变化成为可能，例如阎晓朋等[19]通过CT能谱成像及灌注成像技术对兔肝肿瘤模型中血供变化进行研究，余梁等[20]在VX2移植兔模型实施了肝癌经动脉栓塞术(TAE)后,通过CT与DSA对肿瘤生长和新生血管进行影像学评估，获得理想效果。

2.3 腹腔移植 腹腔移植在操作方面最为简单，而且可出现一定数量的转移、浸润、腹水的案例，但缺点在于不便于瘤体的观察和测量。移植方法是将人肝癌细胞株或者组织碎片注入腹腔内，动物的前侧腹壁比后侧腹壁更有利于癌株的增殖，该模型的应用主要包括：(1)研究HCC侵袭周围组织和肺、肝、肾、肠等远端器官转移的过程；(2)药物筛选试验；(3)通过腹腔移植可以传代和培养，在进行原位或异位移植前，将复苏的瘤株注入目标动物腹腔内传代，待传代完成过后可得到理想数量的肝癌细胞，并且传代后活性更高，对于体内环境适应性更强，提高移植成功率。

2.4 静脉移植 中国肝癌的发病易伴发多种途径转移[21]。肝癌细胞因自发或者诊疗操作进入血液循环系统，称为循环肿瘤细胞(CTCs)，在随血液流动种植于某个器官便发生了肝癌的远处转移，返回残肝或者肝脏组织后种植便是复发性肝癌[22]，作为一种新兴的肿瘤标记物，又称为“液体活检”(Liquid biopsy)[23]，研究CTCS的作用机制，减少其在血液中数目，有利于改善肝癌患者的预后。据报道，免疫疗法对于HCC复发或转移的患者行之有效[24]，因此研究人员需要通过多发转移性肝癌动物模型进行试验，CTCs模型的建立主要方式便是静脉移植，一般是将低剂量的肿瘤细胞注入门静脉或者脾静脉[25-26]。罗桂芳等通过小鼠尾静脉移植体外培养的Hepa 1～6 细胞，也成功的制作出了CTCs模型[27]。通过该类移植模型的建立可更好地研究肝癌的转移机理及探索更有效的治疗策略。

2.5 其他位点移植 除以上的移植位点外还有一些其他的异位转移模型构建，如肾包膜下移植，将瘤株植入两肾包膜下，由于肾脏血供丰富，免疫机能稍差，一般接种成功率高于皮下移植[28]，且易发生远处转移，其他常见的移植位点还包括脾[29]。

3 瘤株选择

3.1 人源性肝癌细胞株 HepG2分离于高加索地区一个15岁白人肝癌患者的肝胚细胞，该细胞系可分泌白蛋白(ALB)、巨球蛋白(a2-MG)等，由于来源的肝癌组织类型为肝母细胞瘤，因此适合用于肝细胞代谢方面的研究，低转移，生长较快。美国模式培养物集存库(ATCC)建议该细胞株在免疫抑制小鼠体内不易致瘤，因此一般移植于免疫缺陷的裸鼠模型中[30]；SMMC-7721，取自于一例HCC患者肝脏组织，甲胎蛋白(AFP)呈阳性，裸鼠体内移植，成瘤率高；Bel-7402，同样为HCC属，特点是异种移植成瘤率高，瘤块组织学病例与HCC类似；MHCC97是由我国一名39岁HCC患者的肝内转移灶标本移植入裸鼠(LCI-D20)而得，分离得到了HCCLM3、MHCC97-L、MHCC97-H 3种细胞株，HCCLM3和MHCC97-H具有高转移潜能，MHCC97-L具低转移潜能[31-32]；Huh-7细胞细胞源自一个日本男性高分化肝癌细胞，能产生一些细胞质蛋白，如白蛋白、a抗胰蛋白酶，AFP阳性，高度分化，乙型肝炎病毒(HBV)阴性，易感丙型肝炎病毒(HCV)，广泛用于异种移植，研究HCV与HCC间关系[33]；PLC/PRF/5称为人肝癌亚历山大细胞，HCC属，可能包含全部HBV基因组，一般用来研究HBV体外病毒与HCC间关系[34]。

3.2 动物源性肝癌细胞株 H22(Hepatoma 22)肝癌细胞是小鼠的肝细胞肿瘤，是由亚氨基偶氮甲苯(OAAT)诱发通过皮下传代的实体瘤，1963年引入我国并作为腹水瘤(Hca、HAC、Hepa)长期保存[35]；Hca-F是从腹水型H22细胞株中筛选出来的特异性向淋巴道转移的小鼠肝癌细胞，一般多用来转移性肝癌模型的构建；Hepa 1-6，鼠肝癌细胞，体外培养形态特征上皮样贴壁生长，来自C57/L小鼠中引发的BW7756肝癌，AFP阳性、产生α1抗胰蛋白酶、淀粉酶；S-180小鼠肉瘤细胞，一般先经腹腔传代培养再进行细胞移植。Walker-256肝癌细胞是将大鼠乳腺癌细胞接种到肝脏成瘤保种传代制作，多移植于Wistar或SD大鼠，一般应用于肿瘤学基础研究和细胞传代[36]，因为其能较好的模拟肿瘤的浸润发展和膨胀式生长，被广泛认可[37]。兔VX2细胞系于1940年建株保存，来源于兔鳞状上皮细胞癌，该癌株在兔同种腋窝下移植成瘤率接近100%，其显著特点是在侵袭时，多种基质金属蛋白高表达，是一种优良的转移模型[38]。

4 不同种属肝癌移植模型的建立策略

4.1 小鼠移植模型 采用品系主要包括：BALB/c小鼠、昆明种小鼠(KM小鼠)。

4.1.1 皮下移植模型：复苏H22肝癌细胞，离心、稀释，调节细胞至2×106个/mL，注射入小鼠腹腔内，传代培养，取第2代后腹水，稀释细胞至1×107个/mL，用注射器抽取0.2 mL细胞悬液，接种到小鼠的右腋窝皮下成瘤[39]。

4.1.2 原位移植模型 原位移植的前期培养和传代与皮下移植模型相同，获得细胞悬液后备用。移植模型术前禁食10 h、禁水4 h，可用4%水合氯醛或者2%戊巴比妥进行麻醉，仰卧保定，常规剪毛、消毒，于上腹剑突下逐层剪开1 cm切口，轻压两侧肋弓，小鼠肝左叶暴露，以与肝平面20 °进针0.5 cm左右，注入0.05 mL悬液，轻压针眼5 min以上，为防止漏液也可用烧红的铁丝封闭针眼，确定稳定后，还纳腹腔，逐层缝合，消毒术闭[40]。

4.2 裸鼠移植模型 裸小鼠(Nude mice)是一种先天无毛小鼠，最早由Flanagan于1966年发现，之后于1969年被Rygaard和Pocvlsen通过实验证实其胸腺先天发育不良[41]，免疫功能缺陷，缺少T细胞，因此在移植方面成功率更高，自1976年Shimosato首次建立了裸鼠人癌移植模型后[42]，国内外学者先后建立了裸鼠皮下、原位、腹腔等移植模型均获成功[43]。但该类模型具有一定局限性：据研究表明，针对HCC患者，采用基因生物免疫疗法有可能成为治疗的最佳方案之一，但裸小鼠由于自身免疫机能缺陷，不适用于此类模型的构建[11]。当前品系主要选择BALB/c裸小鼠。性别选择方面有研究报道：人肝癌细胞HepG2接种于雄性和雌性裸小鼠右侧肩部皮下后，雄性移植瘤增长速度快于雌性鼠，考虑可能是雌性鼠体内的雌激素发挥了抑癌作用，所以在移植试验中一般选择雄性裸鼠[44]。裸鼠移植HepG2模型的建立一般先将细胞株体外培养传代，然后进行移植，可以采用新鲜的瘤块组织或者浓缩的瘤细胞，原位和异位移植的操作方法同小鼠模型。

4.3 大鼠移植模型 由表1可见，大鼠一般采用诱发性致癌以研究原发性肝癌的致病机理。用于移植的大鼠品系一般采用Wistar大鼠、SD大鼠或者Lewis大鼠，瘤株为Walker-256，移植位点一般为原位移植。一种方法是瘤块嵌插法：先将浓度为1×107个/mL细胞的Walker-256瘤株1 mL注入颈部皮下，待皮下移植瘤长至1 cm时，麻醉取出，在Hank′s液中切成1 mm3碎块，取其中1块，在40 min内经剑突下腹部开腹，植入肝叶实质内，压迫止血关腹，据报道移植成功率可达100%[45]；另外一种方法为直接注射法，Walker-256瘤株经常规复苏后经腹腔传代培养，抽取癌性腹水5 mL，清洗、离心后取下层稀糊状液体，调整浓度为3×106个/mL的细胞悬液备用，大鼠禁食12 h，以2%戊巴比妥40 mg/kg·bw腹腔注射麻醉，仰卧位保定、剪毛、消毒，无菌条件下沿剑突下剪开腹壁2 cm，轻压胸腔暴露肝脏，术者左手食指、中指轻夹肝叶，拇指按压边缘以减少肝叶随呼吸的上下运动，针头于肝脏成30 °刺入肝脏约0.5 cm，注入0.05 mL悬液，按压后还纳腹腔，逐层关闭[46]。

4.4 家兔移植模型 以传统应用最多的通过外科手术建立VX2家兔移植模型为例：一般采用耳缘静脉注射戊巴比妥钠(1%，3 mL/kg·bw)，麻醉后以仰卧状态保定，于剑突下腹部剪毛，裸露表皮消毒，逐层沿中央纵行切开腹壁3 cm，牵拉肝左叶使之暴露，缓慢注入浓度为1×107个/mL的VX2细胞悬浮液1 mL，无菌纱布按压至无细胞悬浮液外流后还纳肝脏，逐层关闭缝合，术后7 d连续于耳缘静脉注射头孢曲松钠20 mg/kg·bw·d预防感染[29]。随着影像学的发展和应用，借助经皮肝穿刺胆道造影(PTC)、MR、CT等技术引导，一方面制作肝脏家兔模型更为精确便捷；另一方面还可在手术难以操作的位点移植[16,19]。