人参浸出液对铅暴露鲤鱼卵巢细胞减毒作用研究

尹玉伟，尹玉林，马世宏，茆安婷，秦亚宁，代 静，李月红

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；2.内蒙古乌兰察布市兽医监察所，内蒙古乌兰察布012000；3.河南科技大学动物科学与技术学院，河南洛阳471003)

铅是一种生物机体非必须的重金属，其能破坏机体正常生理功能、免疫功能、神经功能。随着工业的发展，造成铅广泛存在于大气、水体以及土壤。重金属中，铅的毒性最强[1]，并且铅对生物的毒性不存在最小毒性剂量，因此铅只要存在机体便有毒[2]。通过食物链对铅的富集作用，使人较容易摄入高浓度铅[3]。

人参作为“东北三宝”之一，是一种药食两用植物。它能够提高机体抗氧化能力、免疫力，此外还具有抗癌作用，起主要调节作用的物质是人参皂苷和人参多糖[4]。铅作为一种重金属，其能够造成机体氧化应激，刺激金属转运蛋白的表达[5]，而人参对动物重金属减毒作用研究较少，本试验通过萃取的方式的保护人参皂苷和人参多糖，将Rs添加入GCO细胞培养基中，来探究其对铅暴露细胞后的减毒作用，为后续Rs在生产中的使用打下理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂 GCO细胞，购自天津水产研究所；胎牛血清(FBS)和M199培养基，购自美国Gibco公司；人参粉，吉林农业大学中药材学院馈赠；醋酸铅，购自北京化工厂；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒，均购自南京建成生物工程公司；TRIZol，购自大连TaKaRa；FastStart Universal SYBR Green Master购自，Roche公司；反转录试剂盒，购自江苏愚公科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 醋酸铅的配制和人参浸出液的制备 铅溶液母液：3.7934 g三水合醋酸铅。溶于10 mL双蒸水中，配成0.01 mol/L的母液，梯度稀释后进行试验。人参浸出液(Rs)的制备：人参粉加水萃取，萃取之后用蒸发皿蒸发成晶体，取10～15 g晶体溶于5 mL ddH2O，使之饱和，获得人参浸出饱和溶液，使用0.22 μm滤膜进行过滤，按试验浓度加入培养基。

1.2.2 GCO细胞培养 GCO细胞经复苏后，在含有10%FBS的M199完全培养基中培养(含有1×106IU/mL 青霉素和链霉素)，每天进行观察并进行换液，在细胞贴壁达到90%以后进行传代，培养3～4代后进行试验。

1.2.3 MTT法检测细胞活性

1.2.3.1 Pb对GCO细胞活性的影响 细胞复苏后，生长至70%～80%时，用1 g/L胰蛋白酶消化制备细胞悬液，以2.6×104个/孔，接于96孔板，置于27 ℃，5% CO2恒温培养箱中培养24 h。将细胞分为对照组、0.001 mmol/L Pb组、0.005 mmol/L Pb组、0.01 mmol/L Pb组、0.05 mmol/L Pb组，加入不含血清的M199培养基，分别处理1 h和2 h后检测细胞活性。

1.2.3.2 Rs对GCO活性影响 细胞处理同1.2.3.1。将细胞分为对照组、2% Rs组、4% Rs组、6% Rs组、8% Rs组，将细胞用PBS洗3次，之后加入不同浓度Rs的M199培养基，处理后的12 h、24 h测定细胞活性。

1.2.3.3 Pb和Rs对GCO活性影响 细胞处理同上1.2.3.1。将细胞分为对照组(CK)、0.01 mmol/L Pb组(Pb)、0.01 mmol/L Pb加2%Rs组(2%Rs)、0.01 mmol/L Pb加4%Rs组(4%Rs)、0.01 mmol/L Pb加6%Rs组(6%Rs)、0.01 mmol/L Pb加8%Rs组(8%Rs)，所有Pb添加组，Pb处理的时间为1 h， Pb处理结束后添加不同剂量含Rs的M199培养基进行处理，在Rs处理后在12 h、24 h、48 h测定细胞活性。

1.2.4 细胞抗氧化功能测定 试验分组与处理同1.2.3.3。在48 h，对细胞的氧化能力进行测定，测定抗氧化SOD、GSH-Px、CAT指标。

1.2.5 细胞基因表达水平 (1)将细胞接于6孔板后，处理同1.2.3.3。48 h后进行RNA提取，TRIZol法进行提取，总RNA提取之后使用反转录试剂盒进行反转录，cDNA于-80 ℃保存。(2)以β-actin为内参基因，引物信息(见表1)。反应体系20 μL，包括10 μL 2×FastStart Universal SYBR Green Master，上下游引物0.6 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.8 μL。反应条件94 ℃10 min、之后40个循环，94 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s。计算表达量用2-△△Ct。

表1 引物序列信息

1.3 实验仪器 全波长酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；荧光定量PCR仪(ABI公司)；细胞培养箱(Thermo scientific公司)。

2 结果

2.1 MTT法检测细胞活性

2.1.1 Pb对GCO细胞活性的影响 随着Pb浓度和暴露时间的增加，相对细胞活性逐渐降低。Pb浓度分别为0.001、0.005、0.01、0.05 mmol/L暴露时间为1 h时，细胞活性分别降低到86%，80%、74%和63.5%；以相同的浓度暴露2 h时，细胞活性分别降低到75%，71%、61.2%和51.3%。Pb对GCO细胞活性的影响(见图1A)。

2.1.2 Rs对GCO细胞活性影响 随着Rs浓度和暴露时间的增加，相对细胞活性呈先上升后下降的趋势。Rs添加量分别为2%、4%、6%和8%暴露时间为12 h时，细胞活性分别提高到107.8%，116.2%、111%和102.8%；以相同的浓度暴露24 h时，细胞活性分别提高到108.6%，120.5%、111.5%和104.3%。Rs对GCO细胞活性的影响(见图1B)。

2.1.3 Pb和Rs对GCO活性的影响 在所有处理时间点，4%Rs添加时细胞活性显著(P< 0.05)高于Pb、2%RS组、6%Rs组和8%Rs组。Pb和Rs对GCO细胞活性的影响(见图2)。

图1 Pb或Rs对GCO细胞活性的影响

A：不同剂量Pb对GCO活性的影响；B：不同剂量Rs对GCO活性的影响

图2 Pb和Rs对GCO细胞活性的影响

注：图中标有不同字母者表示差异显著(P< 0.05)，标有相同字母的表示差异不显著(P> 0.05)，下图同

2.2 细胞抗氧化测定

2.2.1 Pb和Rs对GCO细胞SOD活性的影响 对照组显著高于(P< 0.05)试验组；4%Rs组SOD显著高于(P< 0.05)Pb组、2%Rs组、6%Rs组和8%Rs组；2%Rs组和6%Rs组SOD显著高于(P< 0.05)Pb组和8%Rs组。Pb和Rs对GCO细胞SOD活性的影响(见图3)。

图3 Pb和Rs对GCO细胞SOD活性的影响

2.2.2 Pb和Rs对GCO细胞CAT活性的影响 对照组显著(P<0.05)低于实验组；4%Rs组CAT显著低于(P<0.05)Pb组、6%Rs组和8%Rs组；2%Rs组和6%Rs组显著高于(P< 0.05)Pb组和8%Rs组；Pb组显著高于(P<0.05)2%Rs组、4%Rs组、6%Rs组和8%Rs组。Pb和Rs对GCO细胞CAT活性的影响(见图4)。

图4 Pb和Rs对GCO细胞CAT活性的影响

2.2.3 Pb和Rs对GCO细胞GSH-Px活性的影响 对照组显著(P<0.05)高于实验组；4%Rs组GSH-Px显著高于(P<0.05)Pb组、2%Rs组、6%Rs组和8%Rs组；2%Rs组显著高于(P<0.05)Pb组和8%Rs组；Pb组显著高于(P<0.05)2%Rs组、4%Rs组、 6%Rs组和8%Rs组。Pb和Rs对GCO细胞GSH-Px活性的影响(见图5)。

图5 Pb和Rs对GCO细胞GSH-Px活性的影响

2.3 MT基因相对表达量 相对于对照组，各组(Pb组、2%Rs组、4%Rs组、6%Rs组、8%Rs组)MT基因表达量分别提高4.2、2.55、1.97、2.58和2.57倍。MT基因的表达量(见图6)。

图6 Pb和Rs对GCO细胞MT基因表达量的影响

3 讨论

研究表明，重金属等进入机体后会增加体内氧化应激，造成氧化压力增加[6]。铅也在很早就被发现，会增加机体的氧化应激[7]。氧化作用是机体必需的生物代谢，其代谢过程中会出现较多的副产物(主要是活性氧；ROS)，这些副产物如不能及时清除，就会使机体产生氧化损伤[8]。Zhang等研究发现，三丁基锡暴露斑马鱼后，SOD随着三丁基锡的暴露浓度增加呈现剂量依赖性降低[9]。Nrf2基因是主要调节氧化应激的基因，研究表明重金属能够抑制Nrf2表达，使机体不能够及移除过多的ROS，从而造成机体产生氧化损伤[10]。人参中的多糖，皂苷以及多肽等物质，都能提高机体的氧化应激能力，记忆力以及非特异性免疫能力，杨迎等通过将人参皂苷Rg1和Rb1饲喂幼鼠后发现，其能够促进神经发育并且有一定的促进生长的作用，同时这种效果能够延续到小鼠成年[11]；另一项研究表明，注射Rg1和Rb1能够加强小鼠水迷宫实验的空间学习记忆能力[12]。夏菁等研究表明，Rg1能够诱导人红白血病TF-1细胞凋亡，其主要的机制是Rg1能够参与JAK通路中蛋白磷酸化，并下调其下游相关的基因，从而诱导细胞的凋亡[13]。本研究中4%Rs组对Pb暴露后氧化应激指标显著提高，其主要原因可能是因为人参多糖和人参皂苷提高了细胞Nrf2的表达，从而使细胞抗氧化能力升高，而2%Rs、6%Rs、8%Rs添加组细胞抗氧化能力提高不明显，2%Rs添加组可能是人参皂苷和人参多糖量不足以调节细胞基因表达所致，而6%Rs、8%Rs添加组细胞抗氧化能力提高不明显可能是由于添加过量，从而影响了细胞的基础代谢所致，但具体的机制还需要进一步的研究。

金属硫蛋白(MT)是参与体内金属转运平衡的重要蛋白，同时其在解毒以及氧化应激中也发挥着重要作用。研究都表明，当水生动物暴露重金属后，MT基因在不同组织中的表达与重金属的暴露存在显著的相关性，也因而被用来作为生物标记物来检测水环境中重金属的污染。MT基因在参与离子平衡时会移除机体非必须的金属，并且研究表明，重金属暴露鱼类后会使MT基因的表达上升[14]，Kim等(2016)通过利用维生素C和铅同时暴露许氏平鲇后发现，维生素C能够减弱铅对MT基因诱导升高作用[7]。李建平(2011)等研究表明，人参多糖能够调节人白细胞K562基因表达谱的改变[15]。本研究中，MT基因的表达量，相对于对照组，各组(Pb组、2%Rs组、4%Rs组、6%Rs组、8%Rs组)MT基因表达量分别提高4.2、2.55、1.97、2.58倍和2.57倍。4%Rs 添加时MT基因的表达量显著降低(P< 0.05)，这可能是由于人参浸出液的添加提高了MT基因活性，使机体能够转运足够的必须金属，来减弱了Pb诱导的MT的提升作用，2%Rs可能是由于添加量过少不足以诱导MT活性，6%Rs和8%Rs可能由于过量的添加导致影响了细胞正常代谢，抑制了MT基因的活性。

综上所述，不同浓度Rs能够缓解Pb诱导GCO细胞毒性，4%Rs添加时最佳。