头孢洛宁乳房注入剂防治干乳期奶牛乳腺炎的药效学研究

肖 霞，李维静，胡 雪，顾梦恬，卜仕金

(扬州大学兽医学院江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009)

为评价我国研制的头孢洛宁干乳期乳房注入剂防治乳腺炎的有效性，本试验拟通过体外敏感性试验、临床药效试验，研究头孢洛宁乳房注入剂对干乳期奶牛乳腺炎的防治效果，并和氯唑西林乳房注入剂防治干乳期乳腺炎的有效性进行比较，以评价头孢洛宁乳房注入剂防治干乳期奶牛乳腺炎的有效性，为制定临床给药方案提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株 质控菌株为金黄色葡萄球菌(ATCC29213第3代)和大肠杆菌(ATCC25922第3代)，购自中国兽医药品监察所。临床菌株由扬州大学兽医学院微生物实验室提供。其中金黄色葡萄球菌(27株)、大肠杆菌(20株)、乳房链球菌(9株)、停乳链球菌(8株)和无乳链球菌(15株)共计79株，均来自扬州某奶牛场患有临床或亚临床型乳房炎牛奶中分离和鉴定的细菌，分离日期为2012年7-8月。

1.2 药品及试剂 苄星头孢匹林、头孢洛宁、阿莫西林、氯唑西林原料药，购自德国Augburg公司；头孢洛宁干乳期乳房注入剂：规格含量250 mg/支，批号111006，由中国牧工商(集团)总公司提供；氨苄西林-苄星氯唑西林乳房注入剂(干乳期)：规格含量4.5 g/支，批号(2012)01005-2056，北京立时达药业有限公司。培养基由上海中科昆虫生物技术开发有限公司提供；BMT检测液：北京市奶牛研究所；Reagent C 裂解液：荷兰ChemoMetec；新生牛血清：浙江天杭生物科技有限公司。

1.3 体外药敏试验 根据CLSI准则测定药物对细菌的最小抑菌浓度(MIC)。根据规定配置药液，用MH肉汤倍比稀释药液，取100 μL药液加入96孔板中，用生理盐水将菌液校正到 0.5 麦氏比浊标准，再用 MH 肉汤1∶100稀释(含菌量约106CFU/mL)，然后每孔接种100 μL。每组设3个重复。同时设阳性对照-接种菌液，不加抗菌药；阴性对照-不接种菌液，不加抗菌药。35 ℃～37 ℃孵育16～20 h。

1.4 试验动物 干乳期奶牛由扬州大学实验农牧场提供。动物入选标准为：(1)治疗时拥有临床健康乳区的临床健康奶牛(无临床型乳房炎的迹象，如乳区肿胀等)；(2)在治疗前2个月内未用抗生素治疗的奶牛。干奶前7 d检查产奶量。

1.5 临床试验分组及给药 试验设2组，即受试药物组、对照药物组。将入选的奶牛按耳标进行分组，其中偶数耳标分配至治疗组，奇数耳标分配到对照组中。每组动物数不少于30头。进入干乳期的奶牛在进行最后一次挤奶，待奶牛的每个乳区的乳汁完全挤干后立即由农场熟练技术人员经乳管向每个乳区分别注入1管受试药物或对照药。给药后轻轻按摩乳区以便药物分散至乳腺的乳池内。给药后奶牛不再挤奶直至产后重新开始泌乳。

1.6 样品采集及处理 在药物治疗至产后14 d内，每天对受试奶牛进行临床型乳房炎检查。在干奶前、干奶期以及产后1、3、5 d，对每头奶牛的4个乳区分别取不少于10 mL奶样作为检测样本。对乳样进行体细胞计数(SCC)和细菌学检查。

1.7 数据处理 通过计算各组治愈率、新近感染率及细菌分离培养情况，并与药物对照组及未用药处理组进行统计分析比较，以确定受试药物防治干乳期乳房炎的有效性。其中，治愈指如果一种病原体在干奶之前被分离出来且同样的病原体在产后采集的此乳区样本中未发现，同时奶牛在干奶期未患有临床型乳房炎的，则可认为该乳区被治愈；新近感染指如果在产后分离出的一种病原体，而在治疗前的样本中不存在该病原体，则可认为该乳区新近被感染。临床型乳房炎的统计单位为奶牛头数，对细菌学分离和SCC测定结果的统计单位为乳区。统计学分析方法采用卡方检验。SCC结果经对数转化后采用t检验分析。

2 结果

2.1 体外抑菌试验 4种抗菌药物(头孢洛宁、头孢匹林、阿莫西林、氯唑西林)对5种细菌的MIC结果见表1。其中头孢洛宁、头孢匹林、阿莫西林、氯唑西林对奶牛乳腺炎大肠杆菌的MIC50分别为4、8、8 μg/mL和>128 μg/mL，MIC90分别为64、64 μg/mL、>128 μg/mL和>128 μg/mL。结果表明，头孢匹林和头孢洛宁对革兰阴性菌具有一定的抗菌活性，与阿莫西林对大肠杆菌的抗菌活性相似。4种药物对乳房链球菌MIC50分别为4、8、16 μg/mL 和128 μg/mL，MIC90分别为8、16、64 μg/mL和>128 μg/mL；停乳链球菌MIC50分别为8、8、8 μg/mL 和128 μg/mL，MIC90分别为16、8、128 μg/mL和>128 μg/mL；无乳链球菌MIC50分别为0.25、4、0.25 μg/mL和32 μg/mL，MIC90分别为4、16、4 μg/mL和>128 μg/mL；MIC测定结果表明，头孢匹林、头孢洛宁和阿莫西林对链球菌比氯唑西林具有更好的抗菌活性。4种抗菌药对金黄色葡萄球菌MIC50分别为0.125、0.25、2 μg/mL和1 μg/mL，MIC90分别为16、16、32 μg/mL和128 μg/mL。试验结果表明，头孢匹林和头孢洛宁对金黄色葡萄球菌高度敏感。

表1 头孢洛宁等对自奶牛乳房炎分离的大肠杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌体外敏感性试验结果 (μg/mL)

2.2 治愈情况 治疗前每个乳区细菌学分离情况见表2，给药至产犊后细菌学治愈率见表3。受试药物组和对照药物组微生物清除率差异不显著，由此可见，受试药物可以有效的防治奶牛干乳期病原菌的感染。

2.3 新近感染发生情况 干奶期及产犊后出现新感染情况见表4，从表中数据可以看出新感染率较低，大多数乳区仍维持阴性状态，由此表明，两组药物都有预防奶牛乳腺炎新感染发生的功效。

2.4 产后体细胞数 产后体细胞数检测结果见表5，以两组乳区个数为个体，统计体细胞数，从表中5可以看出在初乳期间随着泌乳天数和泌乳量的增加，体细胞数逐渐下降，回归至正常泌乳期的体细胞值，两组数据对比P>0.5，差异不显著。

表2 干奶前分离出细菌的乳区数 /%

N*：检查的乳区数量；N：检出细菌的乳区数量；P：百分率(%)；a：受试药物组；b：对照药物组

表3 给药至产后亚临床传染性乳房炎的治愈率 /%，以乳区数表示

表4 干奶期及产犊后出现新感染情况 /%

N：检查的乳区数量

表5 产后体细胞数检测结果 /个

结果表明，干奶前收集的样品中组间细菌学检查没有发现明显的差异。用受试药物和对照药物的治愈率均较好。产后体细胞数也与对照药物差异不显著。可以发现受试药物适用于防治干乳期奶牛乳腺炎的发生。

3 讨论

奶牛乳腺炎发病率高，危害大， 引发该病的因素多种多样，其中微生物感染是最主要的因素[1]。干乳期不但是乳腺感染的高危时期也是防治乳腺炎的理想时期[2]。对于许多病原菌来说，干乳期用药的治愈比例比在泌乳期治愈的比例要高[3]。头孢洛宁对酸和β-内酰胺酶稳定，对革兰阴性菌和革兰阳性菌，尤其对引起奶牛乳腺炎的主要病原菌均具有良好的抗菌活性[4]。体外药敏试验显示，除金黄色葡萄球菌对氯唑西林的MIC50低于耐药折点以外，其余菌属的MIC50均高于32 μg/mL，表现为高度耐药。无乳链球菌及金黄色葡萄菌对阿莫西林MIC50低于耐药折点，表现为敏感，其余细菌对其高度耐药。该结果说明，扬州地区与奶牛乳腺炎有关细菌对青霉素类药物耐药严重。而董翔宸等的报道显示，氨苄西林对从甘肃及周边地区奶牛分离的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及肠球菌的抑菌效果较好，MIC50分别为1.58、2.66、1.61 μg/mL，而对链球菌的MIC50为1.28 μg/mL[1]。分析发现，本研究中细菌对青霉素类抗生素的敏感性要低于其报道的结果，可能的原因是不同地区奶牛乳腺炎的发病情况不同，使用药物种类不同，细菌对药物的敏感性存在差异。调查发现，扬州地区奶牛产业中使用青霉素类抗生素较多，因而其对青霉素类药物耐药性较为严重。所有细菌对头孢洛宁及头孢匹林的MIC50均低于耐药折点，说明扬州地区与奶牛乳腺炎有关细菌对头孢菌素类药物敏感。该结果与已有报道一致，Moroni等测定了68株分离自乳腺炎奶牛的金黄色葡萄菌，发现头孢洛宁对其的MIC50及MIC90为2、16 μg/mL[5]。与阿莫西林和氯唑西林相比，头孢洛宁和头孢匹林对从亚临床奶牛乳腺炎中分离的细菌具有更高的抗菌活性，该结果与已有报道一致[5]。

临床试验表明，氨苄西林-苄星氯唑西林乳房注入剂对不同细菌的治愈率介于50%～87.5%，治疗效果与其他文献报道的结果相似。Cummins和McCaskey报道，通过在干奶期每个乳区注射一支氯唑西林，治愈率可达到73.6%[6]。无论从治愈率、新近感染情况及产后体细胞数检测结果分析，头孢洛宁乳房注入剂对奶牛乳腺炎的防治效果与已上市的氨苄西林-苄星氯唑西林乳房注入剂均相当。Parkinson等比较了氯唑西林与头孢洛宁对于奶牛乳腺炎的疗效，结果显示，两者在防治作用上无差异，但头孢洛宁组的体细胞数低于氯唑西林组[7]。McDougall 比较了自主研发的头孢洛宁乳房注入剂及先灵葆雅公司产品Cepravin，结果显示治愈率均达到90%以上，无显著差异[8]。

研究显示，奶牛干奶期通过乳房单次给药头孢洛宁不但可以提高奶牛乳腺炎的治愈率，而且可以有效的减少新感染的发生，同时，使初乳期间随着泌乳天数和泌乳量的增加，体细胞数逐渐下降，回归至正常泌乳期的体细胞值。该结果与Hogan，Hassan，Schukken等的研究结果相符[9-11]。

4 结论

头孢洛宁对扬州地区亚临床乳腺炎分离细菌(大肠杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌)敏感性略高于头孢匹林，但远高于氯唑西林、阿莫西林。头孢洛宁干乳期乳房注入剂和氨苄西林-苄星氯唑西林干乳期乳房注入剂对于奶牛乳腺炎的防治效果差异不显著。说明头孢洛宁适合用于干乳期防治乳腺炎的防治。对干乳期奶牛每乳区灌注一管250 mg头孢洛宁干乳期乳房注入剂能有效治疗干乳期隐性乳腺炎和预防新的乳腺炎感染。