低共熔溶剂在木质纤维素预处理促进酶水解效率的研究进展*

陈鑫东，熊 莲，黎海龙†，陈新德†

（1.中国科学院广州能源研究所，广州 510640；2.中国科学院可再生能源重点实验室，广州 510640；3.广东省新能源和可再生能源研究开发与应用重点实验室，广州 510640；4.中国科学院大学，北京 100049）

0 前 言

木质纤维素作为最丰富的可再生资源，可替代煤、石油和天然气等不可再生资源生产各种燃料、化学品和材料，引起了学者们的广泛关注。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素以及木质素组成。其中，纤维素是木质纤维素中含量最高的组分，是由β-D-葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接形成的链状多晶型聚合物[1]。半纤维素是由D-木糖基、D-葡萄糖、D-半乳糖基、L-阿拉伯糖基、4-O-甲基-D葡萄糖酸基等多种结构单元组成的无定形多糖化合物[2]。木质素是由对羟苯基丙烷、愈创木基丙烷和紫丁香基丙烷形成的复杂酚类聚合物[3]。半纤维素以非共价键的形式缠绕在纤维素的表面，固定了纤维素[1]。而木质素与半纤维素通过共价键以及物理作用形成木质素-碳水化合物的复合物[4]，如图1所示。该结构对酶降解具有抵抗作用，为增加后续的酶解效率，需对木质纤维素进行预处理，破坏木质素-碳水化合物的原有紧凑结构[5]。

图1 木质纤维素中纤维素、半纤维素和木质素的空间分布[1]Fig.1 Spatial arrangement of cellulose, hemicellulose and lignin in lignocellulosic biomass

传统的预处理包括蒸汽爆破、酸水解和碱处理等方法，但这些方法都有明显缺点。蒸汽爆破法会产生乙酸，对糖的降解会产生抑制作用；酸水解会产生对后续酶解反应有抑制的产物；碱处理对软木的糖类酶解效率低[1]。近些年出现的离子液体，可高效溶解纤维素、半纤维素和木质素，为生物质组分的分离提供了一种新方法，但是由于其制备成本高、有毒性和难回收等缺点，限制了离子液体的进一步发展[6]。FRANCISCO等[7]首次将低共熔溶剂用于木质纤维素的预处理，发现其可高效去除木质素。此后，将低共熔溶剂应用于木质纤维素的预处理得到了科研者的重视，针对低共熔溶剂的性能及其对木质纤维素预处理效果的研究逐渐增多。这些研究表明，低共熔溶剂制备简单、无毒性、可生物降解和易循环使用，可高效去除木质素且对纤维素的溶解性差，对后续的发酵不会产生抑制作用[8]，具有巨大的工业应用潜力。本文首先详细介绍低共熔溶剂的种类和性质，然后总结低共熔溶剂预处理对纤维素、半纤维素和木质素三组分物理化学结构的影响，并讨论其促进酶解的机制，最后对低共熔溶剂应用于木质纤维素预处理进行展望。

1 低共熔溶剂的性质

如图2所示，低共熔溶剂通常由氢键受体和氢键供体之间相互作用形成[9]，一般将氢键受体和氢键供体混合并稍微加热一段时间，形成的均相透明溶液即为低共熔溶剂。这是由于氢键供体和氢键受体之间通过氢键作用使电荷离域，使混合物的熔点低于各组分的熔点[10]。氢键受体一般是大且不对称的离子[11]，例如氯化胆碱和甜菜碱等。氢键供体则可以是有机酸、尿素、醇类等。一般而言，随着氢键强度的增大，熔点降低越明显。某些低共熔溶剂的熔点可以降低至室温[8,12]。

图2 氢键供体季铵盐相互作用示意图[13]Fig.2 Diagrammatic representation of how hydrogen bond donors interact with a quarternary ammonium salt

大多数低共熔溶剂的密度大于水，升温会导致低共熔溶剂密度降低[14]。室温下低共熔溶剂粘度高，这是由于低共熔溶剂中存在大量的氢键网，因此其中自由物种的移动慢[15]，但大规模工业化应用需要较低粘度的低共熔溶剂[16]，可以利用“孔理论”（hole theory）计算并设计具有低粘度的低共熔溶剂[13]。

2 纤维素在低共熔溶剂中的溶解

纤维素是木质纤维素中含量最高的组分。可通过一系列生物化学方法将其转变为可发酵的糖或者其他平台分子等[17]。因此，在低共熔溶剂对木质纤维素预处理时，期望尽可能少溶解纤维素。庆幸的是，研究发现低共熔溶剂对纤维素的溶解度很低。张成武等[1]使用一系列低共熔溶剂对微晶纤维素进行溶解实验，当加入微晶纤维素时，溶液中有悬浮的白色颗粒，说明低共熔溶剂对微晶纤维素的溶解性能差，而且经过低共熔溶剂处理后的微晶纤维素表面变得粗糙不均匀。推测低共熔溶剂处理微晶纤维素的过程使其表面积增大，增大了样品和酶接触的面积，因此一定程度上促进了后续的酶解反应。FRANCISCO等[7]制备了多种低共熔溶剂，例如乳酸-脯氨酸（2∶1）、乳酸-甜菜碱（2∶1）、苹果酸-脯氨酸等。这些低共熔溶剂对纤维素的溶解研究发现，大多数低共熔溶剂对纤维素不溶解，但在苹果酸-脯氨酸的系列低共熔溶剂中，随着脯氨酸的含量增加，对纤维素的溶解度增大。YU等[18]制备了氯化胆碱-甲酸（1∶2）、氯化胆碱-乙酸（1∶6）、氯化胆碱-乙醇酸（1∶4）和氯化胆碱-乙酰丙酸（1∶4）等低共熔溶剂，其纤维素保留率分别为 97.8%、71.1%、54.5%和82.1%。HOU等[19]的实验表明当组成低共熔溶剂的氢键供体中包含更多的羟基时，纤维素的损失率就更小。REN等[20]制备了氯化胆碱-咪唑、氯化胆碱-尿素等低共熔溶剂，发现其对纤维素的溶解度都很低。当然，低共熔溶剂对纤维素的溶解度还受温度影响，一般而言，随着温度的升高，纤维素的溶解率增大。例如，GUO等[21]制备的氯化胆碱-甲酸、氯化胆碱-丁二醇和甜菜碱-乳酸系列低共熔溶剂随着温度的升高，纤维素的损失率均增大。但也有例外，YU等[18]的实验表明低温时纤维素的损失率反而更大。

很明显，低共熔溶剂对纤维素的溶解性较差，VIGIER等[22]认为纤维素和低共熔溶剂均拥有强氢键网，假如纤维素要在低共熔溶剂中溶解就需要两个氢键网分离，然后重新形成一个热力学更加稳定的系统，但是，纤维素的内聚能太强，会阻碍纤维素在任何低共熔溶剂中的溶解。

3 半纤维素在低共熔溶剂中的溶解

半纤维素在低共熔溶剂中的溶解性有两种不同的结果，一些实验表明低共熔溶剂可对半纤维素大幅溶解，也有实验表明低共熔溶剂对半纤维素的溶解性很差。这可能是木质纤维素不同的种类以及低共熔溶剂组成不同导致。YU等[18]制备的氯化胆碱-甲酸（1∶2）、氯化胆碱-乙酸（1∶6）、氯化胆碱-乙醇酸（1∶4）和氯化胆碱-乳酸（1∶4）对木聚糖的去除率分别为87.0%、55.4%、89.7%和47.2%。KIM等[23]以氯化胆碱作为氢键受体，氢键供体分别为对羟基苯甲醇、邻苯二酚、香草醛以及对香豆酸组成的低共熔溶剂，其对木聚糖的去除率分别为28.6%、43.2%、49.6%和70.7%。XU等[24]制备了氯化胆碱-甲酸的低共熔溶剂，用于玉米秸秆预处理，发现其可高效去除半纤维素（66.2%）和部分纤维素，从而有利于后续的酶水解。HOU等[19]使用强吸电子基团Cl-去代替乳酸的羟基时，即氯化胆碱-2-氯丙酸，发现木质素的去除率相当，但是半纤维素的去除率明显增加，表明氢键供体中羧基的α位上有吸电子基团有利于半纤维素的去除。而且，用到的氯化胆碱-2-氯丙酸具有最强的酸性，表现出最好的半纤维素水解性能，原因可能是存在更多的吸电子基团可以进攻木质纤维素且与其组分互相作用，特别是对于酸敏感的半纤维素，这会促进预处理效率。该实验还有一个更有趣的现象是预处理温度在80℃时，增大氢键供体的pKa值（1.25 ～ 3.86），木聚糖的去除能力以指数形式降低，而进一步增大氢键供体的pKa值没有发现木聚糖的去除明显降低；而当预处理温度升高至 120℃时，木聚糖的去除与氢键供体的pKa呈线性负相关。该实验也表明低共熔溶剂可去除大量半纤维素，即使预处理后大量木质素仍然保留在回收固体中，也可以增大后续酶水解效率。这是由于去除大量木聚糖可以产生足够多可供纤维素酶接触的表面积和孔，因此有利于后续的酶水解[25]。但有些低共熔溶剂对半纤维素的溶解度很低，LYNAM 等[26]制备的氯化胆碱-甲酸（1∶2）、氯化胆碱-乳酸（1∶10）、氯化胆碱-乙酸（1∶2）等系列低共熔溶剂对木聚糖的溶解率很低。

4 低共熔溶剂对木质素的去除

木质素是木质纤维素的重要组成部分，目前普遍认为酶水解效率低的原因是木质素对酶降解纤维素阻碍导致[27-28]。因此，去除一定量的木质素是木质纤维素预处理的主要目的。木质素通过氢键作用等方式与半纤维素相连，形成木质素-碳水化合物的复合物[29]。因此，去除木质素即打断木质素与半纤维素的连接。低共熔溶剂中存在大量氢键作用，已有研究证明低共熔溶剂可以打断木质素-碳水化合物的复合物中的氢键和醚键[30-31]。

低共熔溶剂对木质素具有高效去除能力[8,21,32]，去除率甚至可以达到 90%以上[33-34]。低共熔溶剂对木质素的去除效果与其组成有密不可分的联系，不同组成的低共熔溶剂对同种生物质的处理效果不同。而且，当组成低共熔溶剂的氢键供体和氢键受体摩尔比例不同时，处理效果也会不同，ZHANG等[33]制备的乳酸和氯化胆碱组成的低共熔溶剂对玉米芯预处理时，随着乳酸的比例增大，木质素的去除率也增大，并且当乳酸与氯化胆碱的比例增大到15∶1时，木质素的去除率可高达93.1%；YU等[18]使用氯化胆碱和甲酸组成的低共熔溶剂对木通属草药残留物进行预处理时发现，当前者与后者摩尔比为1∶4时，木质素去除效果最佳，当摩尔比增加到1∶6时，木质素去除率反而降低，这可能是由于甲酸过量会降低木质素的去除率。而当使用氯化胆碱和乙酸或氯化胆碱和乙醇酸，当前者与后者摩尔比为1∶6时，木质素的去除效果最佳。当氢键供体与氢键受体的摩尔比改变时，其形成的低共熔溶剂中的氢键强度也会发生变化[35]，这影响其对生物质中木质素的去除。对于同一生物质来说，改变低共熔溶剂中的氢键供体或氢键受体，都会影响其对木质素的去除效果。ZHANG等[33]比较了由氯化胆碱分别和一元酸、二元酸和多元醇组成的低共熔溶剂，分别对玉米芯进行处理，整体比较发现，一元酸的木质素去除率高于二元酸，多元醇也可高效去除木质素。HOU等[19]制备了系列氯化胆碱-多元醇的低共熔溶剂，实验结果表明，包含更长烷基链的二醇比短链的二醇对于去除木质素更有效。另外，制备了系列乳酸-多元醇的低共熔溶剂，比较可知，木质素的去除率随着氢键供体亲水性的增大而降低，这是由于氢键供体中过多的羟基结构会形成更多的氢键，形成的低共熔溶剂更加稳定，且具有更高的粘度，对木质素的去除不利[36]。HOU等[37]的研究还表明，相比于多元醇，基于酰胺的低共熔溶剂表现出更强的木质素去除能力，这是由于木质素是一种碱溶性生物聚合物，酰胺具有碱性，因此会促进木质素的溶解性。KIM等[23]利用木质素衍生物（对羟基苯甲醇、邻苯二酚、香草醛和对香豆酸）分别作为氢键供体，与氯化胆碱形成了一系列低共熔溶剂并进行生物质预处理后发现，木质素去除率的顺序为：对香豆酸（60.8%）、香草醛（52.5%）、邻苯二酚（49.0%）、对羟基苯甲醇（0.4%）。预处理时间和温度等均会影响木质素脱除，一般而言，随着温度的升高，木质素的去除率也增大。GUO等[21]比较了不同系列的低共熔溶剂在不同温度下对木质素的去除率，发现木质素去除率均随温度的升高而增大。LOOW等[38]的实验也表明了同样的结果。这是由于低共熔溶剂在高温时粘度和表面张力降低，有利于低共熔溶剂的扩散，因此促进了木质素的溶解[39]。但是，也有研究表明，温度升高，木质素的去除率反而降低。YU等[18]制备的氯化胆碱-甲酸低共熔溶剂，当摩尔比为1∶6时，120℃时的木质素去除率低于 100℃下的去除率。木质素的去除率受低共熔溶剂的组成及其摩尔比、反应条件等多种因素的影响。

木质素含有自然界中最丰富的芳基[40]，对生物质中分离提纯出的木质素进行升级利用，可有效降低化石资源的消耗。为充分利用木质素且不影响纤维素的后续处理，提出了“木质素优先”的分离策略[41-42]。ALVAREZ-VASCO等[43]制备了氯化胆碱-乳酸的低共熔溶剂，发现可通过沉淀洗涤后得到纯度为95%的新型木质素，其具有相对低且窄的分子量分布，这种新型的木质素保持了原始木质素的大多性能。另外，在新型的木质素中发现酚羟基的核磁强度大于磨碎的木质素，这表明酸性低共熔溶剂可选择性切断木质素中的醚键。XIA等[31]基于酸性多位点配位理论，通过 AlCl3·6H2O在氯化胆碱-甘油中的协调设计了三组分的低共熔溶剂，该溶剂可以通过多位点的桥连配体去裂解木质素-碳水化合物中的氢键和醚键，可以有效提高木质素的去除率，且木质素纯度可高达 (94±0.45)%，可进一步将其转化利用。LIU等[30]利用微波辅助，使用低共熔溶剂对生物质进行预处理，发现可以对生物质的组分有效分离，且提取的木质素表现出低分子量（913）和低多分散度（1.25），且其具有高纯度（96%），具备用于生产芳基化学品的潜在可能性。

木质纤维素预处理会导致其组分发生变化，仅对纤维素而言，期望回收固体中尽可能保留更多的纤维素，以使原料中更多的纤维素转化为目标产物。但是，为了提高后续酶解反应的效率，必须去除部分木质素或者半纤维素，而同时不可避免地去除部分纤维素。因此，在木质纤维素预处理时，应综合这两方面的因素，探索低共熔溶剂对木质纤维素的作用机理，以期达到最好的效果。

5 低共熔溶剂预处理促进酶水解机制

表1为不同预处理条件时木质素和半纤维素去除率及纤维素转化率。由表1可知，随着木质素或半纤维素去除率的增大，酶解效率也增大。木质素和半纤维素形成物理屏障限制了纤维素酶与纤维素的接触[44]。因此，去除部分木质素与半纤维素有利于后续酶解效率，例如，使用碱或者离子液体预处理时，可去除部分木质素，提高后续酶解效率。HUANG等[45]研究发现，酶解效率与木质素的去除率呈明显的线性关系。如上所述，低共熔溶剂可有效去除木质素，去除木质素往往会使比面积增大，这会增加酶对纤维素的可及性。虽然木质素对后续酶水解有不利影响，但是，当木质素的去除率达到一定量时，继续去除木质素不会提高后续的酶水解效率[46-47]。ZHANG 等[33]发现当木质素的去除率超过70%时，进一步增大木质素的去除率不会促进后续葡萄糖的产量增加。SHEN等[34,48]的研究表明，过度去除木质素可能会导致木质纤维素气孔坍塌，使纤维素形成更紧的结构，这使可吸附酶的表面积减小。此外，木质素对纤维素酶的非生产性吸附将减少纤维素对纤维素酶的有效吸附[49-51]。研究表明，木质素中的羟基可导致木质素对纤维素酶的非生产性吸附[52-53]，因此，低共熔溶剂去除或改变木质素结构可降低酶的无效吸附。

表1 不同预处理条件时木质素和半纤维素去除率及纤维素转化率Table 1 Lignin and hemicellulose removal rates and cellulose conversion rates under different pretreatment conditions

半纤维素被认为包裹在纤维素表面阻碍纤维素酶对纤维素的可及性，因此，在纤维素酶中添加木聚糖酶能提高纤维素转化率[55]。此外，半纤维素还可强烈抑制纤维素酶的活性[56]。QING 等[57]的研究表明，与微晶纤维素相比，桦木木聚糖对纤维素酶吸附性能更强。比较经过氨纤维膨胀和稀酸预处理后的残余物对纤维素酶的吸附性，发现前者对纤维素酶的吸附性更强，这是由于与稀酸预处理相比，氨纤维膨胀处理后的残余物中含有更多的木聚糖。这表明半纤维素通过吸附纤维素酶，竞争抑制纤维素酶对纤维素的可及性。一些低共熔溶剂（例如氢键供体为有机酸）可有效去除半纤维素，这既会使更多纤维素表面裸露出来，也可以降低半纤维素对纤维素酶的抑制作用。另外，与木质素的限制能力相比，半纤维素对酶的可及性限制能力较弱[58]。

木质纤维素的结晶度也会对后续酶水解产生重要影响[59]。通过低共熔溶剂降低纤维素的结晶度，使其表面变得粗糙不均匀，从而增加酶对底物的结合位点，从而提高酶水解的效率[8,60]。张成武等[1]用低共熔溶剂对微晶纤维素进行预处理后发现，其表面变得粗糙，且结晶度下降，这表明低共熔溶剂一定程度上破坏了纤维素的晶体结构。但是，木质纤维素的结晶度不仅与纤维素有关，木质素与半纤维素同样会影响结晶度，而且，由于大多原始的木质纤维素中半纤维素和木质素是无定形结构，因此，预处理过程中去除一定量的半纤维素和木质素后，当纤维素的结晶度没有大幅下降时，会使预处理后的木质纤维素的结晶度上升[8]。另外，即使预处理后所得到的结晶度指数相近，但葡萄糖的产率可能会相差很大，因此还需要考虑预处理后的木质纤维素的组成占比。

6 结论与展望

低共熔溶剂在木质纤维素预处理时，可高效去除木质素和半纤维素，但对纤维素的溶解度低，且低共熔溶剂可生物降解，无毒性，对后续操作无抑制作用，是木质纤维素预处理的理想溶剂。但是，目前还缺乏对低共熔溶剂合成的理论指导，低共熔溶剂预处理对后续的酶解效率影响机制还缺乏系统研究。另外，对低共熔溶剂的理性设计及其循环使用的研究还不够，限制了低共熔溶剂在木质纤维素预处理方面的应用。未来，低共熔溶剂对木质纤维素的预处理应集中在以下几方面：

（1）低共熔溶剂的理性设计。研究低共熔溶剂中各分子间的相互作用，深刻理解其形成机理，并联系木质纤维素的特点，设计可用于木质纤维素预处理的低共熔溶剂。

（2）系统研究低共熔溶剂对木质纤维素结构及后续酶解效率的影响。定性和定量分析低共熔溶剂特性（例如各组分的 pKa、烷基链的长度、疏水性和粘度等）对木质素结构及酶解效率的影响，理解低共熔溶剂的作用机理。

（3）木质素高值利用。目前对于预处理过程中脱除的木质素利用研究较少，木质素中含有芳环，对脱除的木质素利用催化等方式使其转变为化学品，以实现木质纤维素全组分利用。

（4）低共熔溶剂的循环使用。循环使用低共熔溶剂可有效降低成本，节约原料，对工业生产具有重要意义。开发低共熔溶剂的回收方法，并深入研究循环次数对木质纤维素预处理及后续酶解效率的影响，寻求低共熔溶剂循环的最佳条件。