阳性养殖环境中鳜体内孔雀石绿及其代谢物残留消除规律

李丽春，刘书贵，尹怡，郑光明，马丽莎，谢文平，戴晓欣，单奇，赵城

(中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部水产品质量安全风险评估实验室(广州)，农业部休闲渔业重点实验室，广州 510380)

孔雀石绿(malachite green, MG)，又名碱性绿，是一种人工合成的三苯基甲烷类工业染料，在水产养殖中常用于防治苗种、水产养殖过程、运输和销售等环节发生的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等[1-3]。其在生物体内可转化为隐色孔雀石绿(leucomalachite green，LMG)， MG和LMG均具有高毒、高残留和“三致”(致癌、致畸和致突变)等副作用，二者在生物体内消除时间较长，会给水产品食用安全性带来严重隐患[4-6]。欧盟等国已将MG列为禁用药，原中国农业部于2002年将其列入《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》，禁止在水产养殖中使用MG[7-9]。但由于MG对水霉病有特效，暂无其他有效替代药，且其价格低廉，易获取，目前仍存在违规使用MG的现象[10-11]。目前，水产品中MG的残留测定方法主要有SDS增敏同步荧光测定[12]、超高效液相色谱-串联质谱法[13-15]、荧光标记磁分离免疫分析方法[16]和QuEChERS结合UPLC-MS/MS法[17-18]等。水产品中MG残留消除规律研究主要涉及的品种包括罗非鱼(Oreochromisniloticus)[19]、斑点叉尾鮰(Ietaluruspunetaus)[20]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[21-22]和大菱鲆(Psettamaxima)[23]等。关于鳜(Sinipercachuatsi)中MG残留消除的研究亦有报道，如刘书贵等[24]和黄向荣等[25]研究了苗种期鳜体内MG的富集消除规律，发现MG及其代谢物LMG在鳜幼鱼体内的残留量分别于停药后37 d和55 d时低于判定值1.0 μg/kg；尹怡等[26]用1.0 mg /L MG溶液浸泡2 min后的鲮(Cirrhinusmolitorella)投喂鳜10 d，研究阳性饵料鱼投喂下鳜体内MG和LMG的残留消除规律，结果表明，养殖过程中，阳性饵料鱼体内的MG会通过食物链传递给鳜，且鳜体内LMG有检出；万译文等[27]采用5.0 mg/L MG浸泡体重为400 g左右的鳜2 h，研究鳜体内MG和LMG的组织分布和消除规律，发现养殖平均水温为25.6 ℃时，MG及其代谢物LMG在鳜各组织中消除至少需要680度日；李丽春等[28]模拟运输条件，研究了鳜体内MG和LMG残留消除规律，结果表明，在运输条件下鳜体内MG 和LMG 消解较慢，易造成鳜中MG 和LMG 超标。可见，目前鳜中MG残留消除规律的研究集中在苗种期、养殖过程和运输环节等，且大多在实验室内进行。鳜体内MG来源问题至今难以解决，养殖环境中的MG和LMG残留是否会造成鳜体内MG和LMG残留尚缺乏有效依据。针对上述问题，本研究通过模拟阳性养殖环境，开展鳜对MG和LMG富集消除规律研究，以期进一步探究阳性环境对鳜体内MG残留的影响，为鳜中MG残留全链条评估和残留关键控制节点的制定提供有效依据，同时为监管部门的管控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

MG、LMG、氘代孔雀石绿(MG-D5)和氘代隐色孔雀石绿(LMG-D6)标准品(纯度≥98%)购于Dr. Ehrenstorfer (德国)。N-丙基乙二胺(PSA)和中性氧化铝购于CNW公司(美国)。氯化钠(分析纯)、无水硫酸镁(分析纯)以及无水乙酸铵(分析纯)购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验仪器

主要包括：Waters UPLC-Xevo TQD MS/MS(Waters公司，美国)；AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；IKA MS3BS25漩涡振荡器(德国)；KQ-250E医用超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TDL-5-A离心机(上海安亭科学仪器厂)；高速离心机(Sigma公司，德国)；Organomation N-EVAP 112氮吹仪(美国)；SIGMA 1-15小型台式高速离心机(Sigma公司，德国))；0.22 μm微孔滤膜，玻璃管等。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

标准储备溶液：准确称取适量的MG、LMG、MG-D5和LMG-D6标准品，分别用乙腈配制成质量浓度为100 μg/mL的标准储备液。

混合标准中间溶液：分别移取上述MG和LMG标准储备液100 μL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成质量浓度为100 ng/mL的混合标准中间溶液，于-18 ℃避光保存。

混合内标标准溶液：分别移取上述MG-D5和LMG-D6标准储备液100 μL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成质量浓度为100 ng/mL的混合内标标准溶液，于-18 ℃避光保存。

混合标准工作溶液：根据需要，吸取一定量的混合标准中间溶液和混合内标标准溶液，用乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液(1∶1，V/V)稀释配制成适当浓度的混合标准工作溶液，使该混合标准工作溶液含中MG-D5和LMG-D6的质量浓度为5 ng/mL。

1.3.2 阳性养殖环境的制备

模拟MG阳性养殖环境，在面积约为1 400 m2、水深1.5 m的池塘中加入MG原药，使水体中MG质量浓度为0.2 mg/L，水体保持7 d，换水后测定其水体和沉积物中MG和LMG残留量，以此为阳性养殖环境。

1.3.3 模拟实验

于阳性养殖池塘中放入健康鳜苗(每尾体重约10～20 g，由广东省佛山市高明区鳜苗种生产农户提供)10 000尾，用阴性饵料鱼喂养，分别于放入鳜后0.1、1.0、2.0、5.0、10、15、20、30、40、50、70、90、120、150、180和210 d等时间点采样，检测鳜体内MG和LMG残留量，直至鳜体内无MG和LMG检出。每个采样点采集6个重复样品，每个样品不低于6尾，样品采集后去头、尾、内脏和骨，高速匀浆混匀后，于-20 ℃保存待测。

1.3.4 样品前处理

样品在室温下解冻后，准确称取(5.00±0.01) g于50 mL的聚丙烯离心管中，加入10 mL乙腈和100 ng/mL混合内标标准溶液50 μL，漩涡振荡2 min，加入2.0 g无水硫酸镁和1.0 g氯化钠，涡旋振荡1 min，超声波提取2 min，5 000 r/min离心5 min，将上清液全部转移至50 mL离心管，剩余残渣中加入10 mL乙腈，重复提取1次，合并上清液然后加入PSA 150 mg、中性氧化铝300 mg和无水硫酸镁300 mg，涡旋振荡30 s，5 000 r/min离心5 min，上清液转移至50 mL玻璃离心管中，40 ℃条件下氮气吹干，用 2 mL乙腈-5mmol/L乙酸铵(1∶1，V/V)复溶，过0.22 μm微孔滤膜，待UPLC-MS/MS测定。

1.3.5 色谱条件

色谱柱为Acquity UPLCBEH C18(2.1×100.0 mm i.d., 1.7 μm)；流动相A为乙酸铵缓冲溶液(5 mmol/L, pH=4.5), 流动相B为乙腈，流速0.20 mL/min, 柱温35 ℃，进样量10 μL，梯度洗脱条件如表1。

表1 梯度洗脱Tab.1 Conditions of gradient elution

注：“φ”指体积分数，A为乙酸铵缓冲溶液(5 mmol/L, pH=4.5), B为乙腈。

1.3.6 质谱条件

采用电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；离子传输毛细管温度350 ℃；离子源温度150 ℃；去溶剂气流速650 L/h，锥孔流速50 L/h：扫描模式为多反应监测(MRM)。质谱参数见表2。

表2 质谱参数Tab.2 MRM parameters

注：“*”代表定量离子。

1.3.7 标准工作曲线的绘制

将1.3.1中的混合标准工作溶液在0.1～100.0 ng/mL的范围内配制成8个质量梯度浓度(0.1、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 ng/mL)，每个浓度水平含5.0 ng/mL内标溶液，采用上述色谱和质谱条件进行测定，以目标物(MG和LMG)与内标物(MG-D5和LMG-D6)的峰面积之比为纵坐标Y，质量浓度为横坐标X绘制标准工作曲线。

1.3.8 回收率和精密度

称取5.00 g空白鳜肌肉样品，加入适量的混合标准工作溶液，使肌肉组织中MG和LMG的含量为0.3、1.5和5.0 μg/kg，按照上述前处理方法和色谱质谱条件检测，每个含量水平设置6个平行样品，测定其日内和日间回收率及相对标准偏差(RSD)。

2 结果与分析

2.1 线性范围、检出限和定量限

用空白样品提取液配制成质量浓度范围在0.1～100.0 ng/mL的基质混合标准溶液作为标准曲线(内标含量为5.0 ng/mL)，按照上述色谱和质谱条件进行测定，绘制标准校准曲线并做线性回归分析。结果表明：在上述色谱质谱条件下可获得较好的基质标准溶液色谱图(图1)，杂质干扰较少且信号响应较高；MG和LMG在0.1～100.0 ng/mL范围内有较好的线性关系,相关系数r大于0.999 8(图2)。

图1 MG和LMG基质标准溶液色谱图(10 ng·mL-1)Fig.1Chromatograms of MG and LMG standard solution (10 ng·mL-1)

图2 MG和LMG标准曲线图Fig.2The standard curves of MG and LMG

在空白样品中添加MG和LMG，分别以信噪比(S/N)等于3和10计算检出限(LOD)和定量限(LOQ)。结果表明，MG和LMG的LOD均为0.10 μg/kg，LOQ均为0.30 μg/kg(表3)。

2.2 回收率和精密度

用不含MG和LMG的鳜为基质进行加标回收率和精密度实验，按照上述前处理和仪器条件进行测定。添加含量水平分别为0.3、1.5和5.0 μg/kg，每个添加水平进行6次重复实验，测定其回收率和精密度。结果表明，鳜肌肉中MG和LMG回收率范围为(96.40±5.34)%～(104.00±1.75)%和(92.40±2.54)%～(107.00±8.42)%，精密度范围为1.68%～5.54%和2.75%～7.87%(表4)。该方法回收率和精密度较好，适用于鳜体内MG和LMG残留量的测定。

表3 MG和LMG的校准曲线、相关系数、检出限和定量限Tab.3 The calibration curves, correlation coefficient, LOD and LOQ of MG and LMG

表4 方法回收率、日内精密度和日间精密度Tab.4 Recovery, within-day precision and inter-day precision of the method n=6

2.3 阳性环境中MG和LMG残留量

质量浓度为0.2 mg/L的MG池塘水体保持7 d后换水，采集水体和沉积物检测其MG和LMG残留量，结果见表5。结果表明，使用过0.2 mg/L MG的养殖池塘7d后换水后的水体中未检出MG和LMG，而沉积物中MG和LMG残留量分别为：(233.48±17.07)μg/kg和(73.38±5.98)μg/kg。

表5 阳性环境水体和沉积物中MG和LMG残留量Tab.5 The residues of MG and LMG in water and sediments

注： “N.D.”表示未检出(<0.1 μg·kg-1)。“—”表示不存在。下同。

2.4 阳性环境中鳜体内MG和LMG残留消除规律

模拟阳性养殖环境，研究鳜在阳性环境中对MG和LMG的富集消除规律。在MG阳性环境中放入鳜苗后，于不同时间点采样，测定其体内MG和LMG残留量，结果见表6和图3。

表6 鳜体内MG和LMG残留量Tab.6 The residues of MG and LMG in mandarin fish n=6

图3 鳜体内MG和LMG富集消除规律Fig.3The enrichment and elimination of MG and LMG in mandarin fish

从表6和图3可知，阳性养殖环境中，鳜体内MG残留量远远低于LMG残留量，其残留量始终保持在1.0 μg/kg以下，0～10 d鳜体内MG维持在0.62～0.80 μg/kg之间,随后呈波动式降低，70 d时达到定量限(0.30 μg/kg)以下，90 d时未检出。而LMG在鳜体内呈明显的先富集后消除的规律，LMG残留量在0.17～9.94 μg/kg之间，均在10 μg/kg以下。由上可见，阳性环境鳜体内MG残留以LMG为主。鳜养殖10 d时体内LMG达到最高水平9.94 μg/kg，随后呈波动式下降，在鳜体内消除较慢，第240天达到方法定量限以下，240 d以后未检出。鳜养殖周期一般为5～8个月，所以环境中残留的MG会造成鳜体内LMG的残留。建议鳜养殖选择没有MG和LMG残留的池塘养殖，并于养殖前对池塘底泥进行检测，确保底泥中不含有MG和LMG残留，且应适当延长鳜养殖周期，以保证鳜的食用安全性。

3 结论

本研究建立了鳜体内MG和LMG的QuEChERS结合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测方法， MG和LMG在0.1～100.0 ng/mL范围内有较好的线性关系,相关系数r大于0.999 8。在空白样品中添加MG和LMG，分别以3倍和10倍信噪比(S/N)计算LOD和LOQ，得到MG和LMG在鳜肌肉中的LOD和LOQ分别为0.10 μg/kg和0.30 μg/kg。在添加水平分别为0.30、1.5和5.0 μg/kg时，鳜肌肉中MG和LMG回收率范围分别为(96.40±5.34)%～(104.00±1.75)%和(92.40±2.54)%～(107.00±8.42)%，精密度范围分别为1.68%～5.54%和2.75%～7.87%，回收率和精密度均符合残留检测要求。本方法操作简单、灵敏、快速且准确性较高，适用于水产品中MG 和LMG残留量测定。

本研究同时采用建立的残留分析方法研究了阳性养殖环境中鳜体内MG和LMG残留消除规律。结果表明，阳性养殖环境中(0.2 mg/L的MG浸泡7 d后换水)，鳜体内MG残留以LMG为主，MG残留量较低且变化不明显，维持在1.0 μg/kg以下， 90 d后无检出。鳜体内的LMG残留量在10.0 μg/kg以下，呈现先增加后降低的趋势，10 d时达到最高水平9.94 μg/kg，随后呈波动式下降，至240 d未再检出，即其在鳜体内消除较慢。因此，养殖鳜时应检测养殖环境中MG和LMG的残留量，选择无残留的养殖环境(水体+底泥)，并适当延长养殖周期，以确保上市鳜体内无MG和LMG残留，保障其食用安全性。