玻璃管动物标签标志曼氏无针乌贼幼体的效果初探

董智勇，刘立芹， 龚理， 刘炳舰，江丽华，迟长凤，吕振明*

(1.海洋生物种质资源发掘利用国家地方联合工程实验室，海洋科学与技术学院，浙江海洋大学； 2.国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江海洋大学： 浙江 舟山 316022)

曼氏无针乌贼(Sepiellajaponica)是中国重要的海洋头足类生物，属软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)、十腕目(Decapoda)、乌贼科(Sepiidae)、无针乌贼属(Sepiella)，是中国传统的海洋渔业资源[1]。20世纪70年代，中国曼氏无针乌贼的历史最高渔获量仅浙江省便达6万 t，占当时浙江捕捞渔业总产量的9.3%，曼氏无针乌贼因而成为著名的东海“四大海产”之一[1]。但70年代末以来，由于过度捕捞和水域条件遭破坏，中国的曼氏无针乌贼渔业资源衰退严重，至目前已无法形成渔汛，自然资源已近枯竭[2]。为保护中国曼氏无针乌贼自然资源，国内科研工作者开展了系列工作，并于21世纪初突破了曼氏无针乌贼的人工繁育技术瓶颈，随后其规模化人工增殖和资源养护工作也在中国沿海陆续展开，并取得了初步成效[3]。但至今，中国尚未能对已坚持多年的曼氏无针乌贼增殖放流和资源养护工作的实际效果进行有效评估，其根本原因是尚未形成一套有效的曼氏无针乌贼的标志放流技术体系，因此，开展曼氏无针乌贼标志方法的研究已迫在眉睫。

当前，国际社会已开展了多种在海洋头足类增殖标志方法方面的研究。其中，体外物理标记法、化学标记法及电子标签法等传统标志技术在海洋头足类中均有所应用[4]。但相对而言，物理标记法具有标记保存率低、标记过程易造成机体损伤等缺点；化学标记法也存在识别困难、标记检测时需杀死个体等不足，在海洋头足类方面的运用已逐渐减少[4]。而电子标签法具标记容易识别、保存率高和低损伤等优点，已逐步在海洋头足类标志中得到广泛的运用[4]。如Anderson等[5]采用无源应答器标志法(PIT tag)在实验室和野外条件下对郁蛸(Octopustetricus)和毛利蛸(Octopusmaorum)进行标志，结果表明，实验期内(室内持续14个月；野外持续13个星期)两种蛸体内电子标签的保存率均为100%，且标志后对蛸的生长和存活均无明显影响，证明无源应答器标志是一种较为有效的头足类标记方法； Scheel等[6]采用声呐发生器(sonar transmitter)标志在野外条件下对40尾水蛸(Enteroctopusdofleini)进行标记，结果表明，水蛸在88 d的实验期中对声呐发生器标记的保存率为83%，并可实时记录水蛸完整的活动轨迹和迁移过程，是非常理想的头足类标志方法。然而，电子标签标记法至今未在曼氏无针乌贼个体标志中得到运用，仅见Jiang等[7]及董智勇等[8]采用四环素、茜素络合物等荧光标记法对曼氏无针乌贼进行了标志。基于上述情况，本研究拟采用玻璃管动物标签法对曼氏无针乌贼幼体进行标志，研究其标志效果及其对曼氏无针乌贼行为、生长及存活率等的影响，旨在探索建立一种适于曼氏无针乌贼的电子标签标志方法，为今后曼氏无针乌贼增殖放流的效果评估及放流工艺的优化提供支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

标志用曼氏无针乌贼幼体采自浙江海洋大学校级实验基地(东极苗种繁育中心)自培育乌贼苗种，当幼体长至40日龄，胴长2.63～2.88 cm，体重3.47～4.69 g时，随机挑选健康苗种220尾，用于后续的标志实验。标志用玻璃管动物标签及配套检测设备购于广州洪腾条码技术公司，标签型号为HT157，规格为1.5 mm×7.0 mm。

1.2 实验方法

1.2.1 乌贼的麻醉

为避免标志过程中乌贼幼体发生喷墨死亡，标记前参照Wearmouth等[9]的方法将乌贼幼体进行麻醉，具体方法是：将乌贼幼体移入50 L含1.9%的MgCl2·6H2O海水溶液中，3～5 min后乌贼即麻醉失去平衡，待乌贼完全丧失对外界刺激的反应时即可进行后续的标志操作过程。

1.2.2 乌贼的标志

将玻璃管动物标签及配套的注射针头用酒精棉球消毒后，将标签装入注射器针头内，以15°～ 45°将针头从乌贼背部刺入内壳包膜下，推动注射器将玻璃管动物标签植入内壳包膜内，缓慢拔出针头，注射针孔处用酒精棉球消毒后即标志完毕。标志过程最好在乌贼麻醉后3～5 min内完成，以免麻醉时间过长造成乌贼复苏困难，共标志乌贼幼体110尾。实验同时设对照组，将110尾对照组乌贼麻醉，并用无标签的空载注射针头扎入内壳膜下，但无动物标签注入，其他操作过程同标记组。

1.2.3 标志后管理

将标志好的乌贼幼体直接投入盛有清洁海水的养殖池中，加大养殖池水的氧气充气量，数分钟后乌贼幼体即能逐步复苏。将成功复苏的104尾带有标签的标记组样品与97尾无标签的对照组样品在同等条件下进行养殖，养殖水温为26～28 ℃，盐度为25～32，以鲜活野杂鱼或野杂虾为饵料进行投喂，日投喂量为乌贼体重的20%，每日投喂2次为宜，正常进行吸污及其他日常养殖管理。

1.3 数据分析与处理

养殖过程中，每日记录标记组和对照组乌贼的死亡情况，统计累积死亡率，检查标记组的标签保持情况，标签检测时采用肉眼观测和标志阅读器读码自动识别相结合的方法进行，读码时将标志阅读器靠近乌贼7～10 cm处，即可读取乌贼体内标签的编码。同时在标志后0、10、20、30、40和50 d(已至成体)时采集乌贼样品，分别测量标记组和对照组乌贼的全长、胴长、胴宽、体重、壳长、壳宽及壳重等生长性状参数，计算瞬时生长率(IGR)，分析乌贼的生长情况，IGR=(lnw2-lnw1)/(t2-t1)×100%，其中w2和w1分别为t2日龄(d)和t1日龄(d)时的乌贼体重(g)，采用SPSS 19.0统计软件比较标记组和对照组在死亡率和生长指标上的差异，并对差异的显著性进行T检验(Student′s t test，生长指标)和卡方检验(χ2，死亡率)。

2 结果与分析

2.1 标志效果与保持率

将玻璃管动物标签(图1A)注入曼氏无针乌贼内壳包膜下，乌贼背部在标签注射部位旋即形成一突出隆起，注入初期，由于乌贼幼体皮肤较薄而透明，内壳包膜下的玻璃管动物标签仍隐约可见(图1B)。但随着乌贼个体的生长，玻璃管动物标签逐步被增生的皮肤、肌肉和包膜组织掩盖(图1C)。标志40 d时，乌贼体内的玻璃管动物标签甚至被新形成的内壳组织所包裹，逐步嵌入内壳而成为内壳中的一部分(图1D)。即便如此，乌贼背部玻璃管动物标签包埋而形成的隆起仍十分清晰可见。但由于标签的规格和尺寸较小，在整个实验过程中未见其对乌贼幼体行为活动产生明显影响，乌贼能正常活动、摄食和生长。实验过程中未发现标记脱落的情况，实验结束时，乌贼体内标签的保持率达100%，该结果与无源应答器标记(PIT tags)[5,10]、档案式标签(archival tags)[9]等电子标签标志海洋头足类的效果及标记保持率相当，且大大高于植入式荧光数字标记(visible implant alphanumeric tags)[11]、彼得逊盘(petersen discs tags)[12]等体外物理标志对海洋头足类的标记效率和保持率。标记后的曼氏无针乌贼在靠近扫描阅读器7～12 cm范围内时，可准确读取玻璃管动物标签的编码。该结果表明，玻璃管动物标签具有标志效果好、识别简便及保持效率高等优点，是一种较为理想的乌贼增殖放流标志。

图1 玻璃管动物标签法标记曼氏无针乌贼的效果A为玻璃管动物标签；B为标签的埋植；C为标记后的乌贼；D为内壳膜下的动物标签。Fig.1The effects of tagging on Sepiella japonica juveniles with animal glass tube tagsA：animal glass tube tags used; B：the implant process of the tags; C：Sepiella japonica with tags； D：the implanted tags in the cuttlebones of Sepiella japonica.

2.2 标志对乌贼生长发育的影响

标志后的曼氏无针乌贼仍保持较为迅速的生长速率，50 d后即可达成体规格，瞬时生长率可达5.93%/d，该生长速率与前人测定的正常养殖条件下的乌贼生长速率相当[13]。对标记组和对照组乌贼的生长情况进行比较，结果表明，在7个主要生长性状参数上，除30 d时的全长、壳宽及50 d时的全长等少数指标外，标记组和对照组乌贼生长均无显著性差别(P>0.05)(表1，图2)，且标记组和对照组曼氏无针乌贼在标志50 d后均可达性成熟，推测所用的HT157型玻璃管动物标签规格较小，对标志个体的活动、摄食等行为影响小。类似的结果也在植入式荧光数字标记法(visible implant alphanumeric tags)标志银磷乌贼(Sepioteuthissepioidea)[14]、无源应答器(PIT tags)标记法标志真蛸(Octopusvulgaris)[10]中有发现。值得注意的是，从表1和图2的数据分析，标记组在几乎所有生长性状参数上均略高于对照组，尽管绝大多数未达统计学意义上的显著性差异，但在一定程度上提示了还有必要进一步优化玻璃管动物标签的规格及埋植部位，以最大限度地降低标志对乌贼生长发育的潜在影响。

2.3 标志对乌贼存活率的影响

本研究还对标记组和对照组曼氏无针乌贼存活情况进行了为期50 d(已至成体)的跟踪统计，结果表明，玻璃管动物标签标志并未对乌贼的存活率产生明显影响。从累积死亡率来看，50 d的养殖中，标记组和对照组曼氏无针乌贼的累积死亡率分别为21.15%和17.53%，经卡方检验两者间未呈现显著性差异(P>0.05)(表2)，在部分时间点上，如第10天和第40天时标记组的累积死亡率甚至低于对照组；从阶段性死亡率来看，标志后短期损伤可能较大的前期(第0～20天)的死亡率也与后期(第20～50天)的死亡率相当，因此实验过程中曼氏无针乌贼的死亡可能更多来源于养殖过程中的自然死亡，且死亡率与平洪领等[13]室内养殖条件下获得的曼氏无针乌贼的死亡率相当。较高的标志存活率在其他海洋头足类中也多有发现，如Estefanell等[10]采用无源应答器标记法(PIT tags)标志真蛸获得了46.4%～100%的存活率；Anderson等[5]采用同样的方法标志郁蛸(Octopustetricus)和毛利蛸(Octopusmaorum)获得了100%的存活率；前期本课题组采样背部内壳膜下注射茜素络合指示剂的方法标记曼氏无针乌贼也获得了81.63%的较高存活率[8]。本研究采用玻璃管动物标签标志曼氏无针乌贼成活率较高的原因，一方面可能是由于标志时所用的针头及标签规格较小，在注射时不会造成肌肉和皮肤大面积损伤，减少了因继发性感染而引起的死亡；另一方面则是由于海洋头足类本身有较强的损伤后自愈能力，Wearmouth等[9]研究了档案式标签法标志商乌贼(Sepiaoffificinalis)后的愈合能力，结果表明：标志过程中，商乌贼背部形成的直径2.8 mm、深5 mm的标志位点在一个月后即完全愈合，且未出现任何感染迹象，可见海洋头足类的自愈能力较强。本实验的研究结果进一步证实了玻璃管动物标签法是一种低损伤的头足类标志方法，在今后曼氏无针乌贼大规模标志放流中具有较好的潜在运用价值。

表1 玻璃管动物标签标记对曼氏无针乌贼生长的影响Tab.1 The effect of animal glass tube tagging on growth performance of Sepiella japonica

注：表中数据右上标不同字母代表对照组与标记组差异显著(P<0.05)。“—”表示无具体数据。

表2 玻璃管动物标签标记对曼氏无针乌贼存活率的影响Tab. 2 The effect of animal glass tube tagging on survival rate of Sepiella japonica

图2 玻璃管动物标签标记对曼氏无针乌贼生长的影响(n=6)A：标记对乌贼全长、胴长和胴宽的影响；B：标记对乌贼壳长和壳宽的影响；C：标记对乌贼体重的影响；D：标记对乌贼壳重的影响。Fig.2 The effect of animal glass tube tagging on growth performance of Sepiella japonica(n=6)A:The effect of tagging on total length, body length and body width of Sepiella japonica; B:The effect of tagging on shell length and shell width of Sepiella japonica; C:The effect of tagging on body weight of Sepiella japonica; D:The effect of tagging on shell weight of Sepiella japonica.

3 结论

玻璃管动物标签法可有效应用于曼氏无针乌贼幼体的标志中。本研究将玻璃管动物标签植入曼氏无针乌贼幼体内壳包膜下后，可在其背部标签所在位置形成突出的隆起，易识别，且在靠近标签7～12 cm范围内通过阅读扫描器快速准确识读。标志后，乌贼体内的玻璃管动物标签被新形成的内壳组织所包裹，逐步嵌入内壳而成为内壳中的一部分，从幼体至成体50 d内的标志保存率为100%。玻璃管动物标签标志对乌贼的行为活动、生长和存活均无显著性影响(P>0.05)。玻璃管动物标签在今后曼氏无针乌贼及其他海洋头足类生物的大规模标志放流中具有较大的潜在应用价值。