海参蛋白肽粉吸湿诱导其挥发性物质变化规律的研究

2019-10-23董翼飞鞠化鹏杨薏颖孙娜林松毅

中国渔业质量与标准 2019年5期

董翼飞, 鞠化鹏, 杨薏颖, 孙娜, 2, 林松毅, 2*

(1. 大连工业大学食品学院，辽宁大连 116034；2. 国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁大连 116034)

近年来，以海参为原料所制备的易吸收、高营养效价的海参蛋白肽备受产业界和科研界重视。研究表明，海参蛋白肽具有抑制血管紧张素转换酶、清除自由基以及抑制结肠癌HT-29等生物学活性[1]，能防止血管末稍收缩，起到降血压的作用[2]。海参蛋白肽具有很强的抗氧化能力[3]，可以起到延缓衰老[4]、抗疲劳[5]的作用，常与基料粉营养配伍用于高质高值化食品开发。然而，在其加工储藏的过程中，往往存在吸湿、结块等品质劣变的问题。随着贮藏时间的延长，海参蛋白肽粉吸湿后会伴随变性、变质及挥发性物质的产生、多肽质构变化和功能丧失等问题，严重降低了其贮藏稳定性，影响其应用[6]。目前国内外很少有对于其吸湿特性以及在干燥环境贮藏过程中其品质变化规律的研究报道。

本研究结合动态水分吸附法(dynamic vapor sorption, DVS)、低场核磁共振技术(low-field nuclear magnetic resonance, LF-NMR)及气相色谱-离子迁移谱联用技术(gas chromatography-ion migration spectra, GC-IMS)，对干燥环境下贮藏的海参蛋白肽粉诱导其挥发性物质进行分析鉴定。DVS可在受控条件下快速准确地获得吸附数据[7]。楼佳颖等[8]利用DVS对不同烟草原料进行了等温吸湿-解湿行为的研究。LF-NMR是一种快速、无损且低成本的检测技术，能很好地反映食品中质子的分布和迁移率[9]，从微观角度阐明样品中水分的变化规律。张绪坤等[10]通过LF-NMR研究了胡萝卜切片在干燥过程中内部水分变化的特征。Song等[11]将LF-NMR与MRI技术相结合，对鲍鱼(Abalone)的水迁移率和分布进行了实时动态分析。GC-IMS是一种用于分析样品中挥发性化合物的检测方法，具有高分离能力的气相色谱(GC)对挥发性物质进行预分离，IMS检测器可对挥发性组分进行分析[12]。因为GC-IMS联用技术表现出高度的正交性，所以研究的选择性和峰值容量得到改善[13]，目前已广泛应用于食品样品中挥发性化合物的分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

动态水分吸附分析仪DVS Advantage RW 33EBSS1/XEU (英国SMS公司)；核磁共振成像分析仪MesoMR23-060V-I (苏州(上海)纽迈电子科技有限公司)；FlavourSpec®风味分析仪(德国G.A.S.)；300 mm棕色干燥器；BSA223S电子分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。

海参蛋白肽粉采购于大连非得生物产业有限公司，实验用水均为Milli-Q纯水系统制备的超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理

称取一组0.022 g(精确至0.001 g)海参蛋白肽粉用于DVS实验。分别称取1.5 g(精确至0.1 g)海参蛋白肽粉，于6瓶20 mL顶空进样瓶中在干燥器中贮藏0、5、10、15、30、90 d备用，进行LF-NMR实验。依次称取0.5 g(精确至0.1 g)海参蛋白肽粉，于12瓶20 mL顶空进样瓶中，两两一组作为平行对照在干燥器中贮藏0、5、10、15、30、90 d备用，进行GC-IMS实验。

1.2.2 实验条件

1)DVS条件

动态水分吸附分析仪RW33EBSS1/XEU，控制温度25 ℃，总气体流速500 mL/min，湿度范围为0～95% RH。

2)LF-NMR条件

中心频率(O1)为172 109.42 Hz，重复采样等待时间(TW)为2 000 ms，信号采样点数(TD)为60 052.00，回波时间(TE)为0.3 ms，回波个数(NECH)为1 000 个，重复扫描次数(NS)为16次。

3)自动顶空进样单元

孵育温度50 ℃，孵育时间40 min，孵化转速500 r/min，进样体积500 μL，进样针温度85 ℃，孵化转速500 r/min。

4)GC条件

色谱柱类型为FS-SE-54-CB毛细管柱(15.00 m×0.53 mm×0.50 μm)，色谱柱温度40 ℃，运行时间25 min，载气N2纯度≥99. 999%。流速：初始2 mL/min；保持2 min，流速增速至30 mL/min；保持8 min，增速至100 mL/min；保持10 min, 增速150 mL/min；保持5 min。

5)IMS条件：IMS温度 45 ℃，载气N2纯度≥99. 999%。

1.2.3 实验内容

1.2.3.1 DVS实验

参考Wang等[14]的方法进行DVS实验。将准备好的样品放入动态水分吸附仪样品盘上，在动态水分吸附仪中通入恒定流量的高纯氮气，平衡至实验温度为25 ℃，RH为0%。样品质量和相对湿度等数据每隔1 min自动记录一次，当样品质量变化速度连续两次的差值小于0.002，或者平衡时间超过360 min时，则认为样品达到吸湿平衡，强制递增至下一级相对湿度。样品室中0～90% RH以10 %的湿度梯度变化，90%～95% RH之间以5%梯度变化，相对湿度从最小值0上升到最大值95%再降至最小值0，完成2次循环。

1.2.3.2 LF-NMR实验

参考Wang等[15]的方法进行LF-NMR实验。按照实验分组，将达到实验时间点的样品依次送入核磁玻璃管中运行CPMG序列，通过检测自旋-自旋驰豫时间T2反演，利用低场核磁共振CPMG序列测量样品，获得T2驰豫时间分布曲线。每个样品平行测定3次，所得数据均表示为均值±标准差(mean±SD)。采用Excel 2010软件(Microsoft Corporation，USA)及Origin 8.5(OriginLab Corporation. MA，USA)软件处理数据和作图。

1.2.3.3 GC-IMS实验

将达到实验时间点的分别为0.5 g的2瓶海参蛋白肽粉自动进样到色谱柱进行分离，分离完成后进入温度为45 ℃的IMS单元，均测定2次，完成后通过软件内置的LAV(laboratory analytical viewer)获得海参蛋白肽粉在干燥环境下贮藏0、5、10、15、30、90 d的特征指纹图谱。

2 结果与分析

2.1 基于DVS方法分析海参蛋白肽粉吸湿特性

运用DVS系统，获得25 ℃时的海参蛋白肽粉的水分吸附-解吸动力学曲线，如图1A所示。右纵坐标轴为设定梯度变化的相对湿度，左纵坐标轴为已设定的不同梯度内的海参蛋白肽粉的质量变化，横坐标轴为实验时间。

从图1A可知，在0～40% RH、80%～95% RH时，样品质量变化率很低，50% RH时吸湿不明显，质量变化率趋近于0，而在50%～60% RH的过程中，质量变化率开始逐渐增加，70%～80% RH质量变化率显著增加。95% RH时质量没达到最大，由于还未达到其吸湿极限而继续吸湿，在下降到90% RH时达到最大。而后随着相对湿度梯度下降，样品解吸，质量减少，95%～40% RH质量变化率较大且恒定，40%～30% RH质量变化率达到最大，30% RH之后质量缓慢减少直至RH为0，进入下一次循环。

图1 海参蛋白肽粉贮藏过程中的吸湿等温线A：吸附-解吸动力学曲线；B：吸附-解吸等温线。Fig.1Moisture sorption isotherm of sea cucumber protein peptide powders during storageA：Adsorption-desorption kinetic curve；B：Adsorption-desorption isotherms.

图1B横坐标为设定梯度变化的相对湿度，纵坐标为已设定的不同梯度内的海参蛋白肽粉的质量变化。红色线代表第1次吸湿过程，在0～50% RH时，样品质量变化率很低。在50%～95%RH时，样品质量变化较大，相对湿度每增加10%，样品质量随之增加20%，当达到90%～95% RH时，样品的质量达到最大。蓝色线表示样品第1次解吸过程，随着样品相对湿度减小，样品质量减小，在相同的相对湿度下，样品解吸时的质量大于样品吸湿时的质量。第1次吸湿解吸和第2次吸湿解吸变化规律基本吻合，说明第1次吸湿解吸对第2次吸湿解吸基本无影响。

2.2 基于LF-NMR分析海参蛋白肽粉水分迁移规律

从图2A中可以看出，随着T2驰豫时间的增加，6组不同贮藏天数下的驰豫图出峰时间及峰型相似。驰豫图中有3种信号峰T21、T22、T23，分别对应3类水组分，其中峰面积越大说明氢质子信号强度越大[16]。在驰豫图中弛豫时间约1 ms的T21峰被认为是自由度较低的结合水，其次T22为固定化水，T23为自由水。通过对峰面积进行积分计算出水分含量。如图2B所示，0～10 d时自由水所占比例逐渐减少，10～90 d时自由水比例逐渐增大。整体来看，各水分比例维持恒定，90 d时固定化水比例达到最小。对比图2B与图3A可知，自由水相对含量最少，固定化水相对含量最大。

图2 LF-NMR弛豫时间图及其积分柱形图A：T2驰豫时间分布曲线；B：单位质量总水分含量变化图。Fig.2LF-NMR relaxation time diagram and its integral column diagramA：T2 relaxation time distribution curve；B：Chart of total moisture content per unit mass.

图3 海参蛋白肽粉贮藏过程中的单位质量水分变化A：海参蛋白肽粉中不同状态单位质量水分含量变化；B：海参蛋白肽粉的单位质量总水分变化。Fig.3Changes of water contents per unit mass in sea cucumber protein peptide powders during storageA：Changes of water contents per unit mass in different states of sea cucumber protein peptide powders； B：Changes of total water contents per unit mass in sea cucumber protein peptide powders.

分析图3A与图3B可知，海参蛋白肽粉从开始贮藏到贮藏90 d后，整体单位质量总水分明显增加，其中在第10天达到最大值，原因可能为贮藏10 d时其具有强吸湿性，会富集干燥环境中的水分，并将自由水转化为固定化水和结合水，使得在贮藏第10天时，单位质量总水分最大。而后由于海参蛋白肽粉挥发解吸，总水量开始明显下降，结合水和固定化水转化为自由水，由于其自身的强吸湿性导致水分含量继续增加，直至达到动态平衡趋于饱和。从图3B中可知，海参蛋白肽粉的单位质量总水分从0 d的(394.41±4.29)(au·ms)/g增长至90 d的(416.37±4.49)(au·ms)/g，呈明显上升趋势，说明其在贮藏过程中不断吸收环境中的水分。其中，整体水分质量在第10天达到最大值(423.15±0.18)(au·ms)/g，说明在贮藏10天左右海参蛋白肽粉的吸湿性明显增强。

2.3 基于GC-IMS分析挥发性物质变化规律

基于GC-IMS技术的指纹图谱，对海参蛋白肽粉品质的快速无损检测提供了至关重要的理论依据。指纹图谱直观地反映化合物浓度的变化，通过离子迁移谱和指纹图谱定性化合物，获得不同贮藏时间内具体挥发性物质的浓度变化规律。通过确定诱导关键挥发性物质的时间范围以及某些关键物质的生成时间及条件，有助于优化贮藏条件，延长海参蛋白肽粉的贮藏时间。GC-IMS结合了分离和检测两方面的优势，可以实现挥发性物质快速定性鉴定。利用分析软件GC×IMS Library Search内置的NIST2014数据库对图谱中的物质进行定性分析，并与各色谱图进行比对得到图4，再将定性后的数据导入软件LAV(laboratory analytical viewer)，通过LAV内置的Gallery Plot插件得到图5。

由图4和图5得出，1-戊醇(1_pentanol, 1-2)、2-己烯醇(2_hexenol, 5-6)、2,3-戊二酮(2_3_pentanedione, 11-12)、2-戊酮(2_Pentanone, 13-14)、2-丁酮(2_Butanone, 19-20)、2,3-丁二酮(2_3_butanedione, 21)、二甲基三硫(dimethyl-trisulfide, 25)、2-甲基丙酸(2_methylpropanoic-acid, 30)、3-甲基-1-丁醇(3_Methyl_1_butanol, 31)及2-戊酮(2_Pentanone, 32)在0 d时含量最大，随着贮藏时间的增加，含量逐渐变小。苯甲醛(benzaldehyde, 3-4)在0 d时含量最多，5 d时含量减少，并在5～90 d内含量保持不变。乙酸乙酯(ethyl-acetate， 17-18)在10 d时含量特异性增加，在第10天后含量下降至与0～5 d相同水平。随着贮藏时间的延长，多数化合物浓度明显减低，有个别化合物在贮藏10 d后生成，如10 d-2浓度增加的化合物壬醛(n-Nonanal, 22)、10 d-1浓度增加的2-甲基丙醛(2_methylpropanal, 35)，在贮藏30 d时浓度显著增加的己酸(hexanoic acid, 24)。

3 结论

本研究通过DVS分析出海参蛋白肽粉样品在不同湿度梯度内的水分迁移特性，更快速地获得海参蛋白肽粉的吸湿等温线，指导其包装及选择最佳的储藏条件，且对于确定其储存期具有参考价值。基于LF-NMR技术建立T2驰豫时间分布曲线，得到不同贮藏时间下3种状态水互相迁移转换的变化规律,发现贮藏10 d左右的海参蛋白肽粉的吸湿性明显增强，单位质量总水分最大。结合DVS与LF-NMR来研究海参蛋白肽粉中的水分迁移规律更加深入。通过GC-IMS进行定性分析，实现对干燥环境下贮藏不同天数的海参蛋白肽粉品质的快速检测。若能结合标准物质特征图谱进行定量分析[17]，GC-IMS就可一步实现对同一品种海参蛋白肽粉的等级鉴定。通过DVS和LF-NMR技术得知，50% RH时海参蛋白肽粉吸湿不明显，质量变化率趋近于0，在50%～60% RH的过程中，质量变化率开始逐渐增加，70%～80% RH质量变化率显著增加，说明低于50% RH有利于减弱其吸湿行为，70%～80% RH环境下的海参蛋白肽粉吸湿能力极强，不利于储藏。经测定，海参蛋白肽粉的整体水分质量在第10天达到了最大值，为(423.15±0.18)(au·ms)/g，说明在贮藏10 d左右时，其吸湿性明显增强，会富集干燥环境中的水分，并将自由水转化为固定化水和结合水。结合基于GC-IMS技术的指纹图谱定性出的挥发性物质可知，在贮藏10 d后其诱导某些挥发性物质浓度增大，如壬醛(n-Nonanal, 22)、2-甲基丙醛(2_methylpropanal, 35)及己酸(hexanoic acid, 24)。因此得出结论，在干燥环境下海参蛋白肽粉的最佳贮藏时间段应控制在10天内，10天之后，由于海参蛋白肽粉的强吸湿性会诱导挥发物质的产生，导致其营养价值降低。综合以上3种技术，快速确定挥发性物质的种类，探究出其内部水分迁移规律，可用于预防有害物质生成。本研究对于海参蛋白肽粉诱导其挥发性物质的鉴别分类具有研究延展性，可避免肽粉因贮藏不当而变质，延长其货架期，对其品质的快速鉴定有良好的应用前景。

图4 海参蛋白肽粉的GC-IMS对比图1：1-戊醇；2：1-戊醇；3：苯甲醛；4：苯甲醛；5：2_己烯醇；6：2_己烯醇；7：己醛；8：己醛；9：己醛；10：己醛；11：2,3-戊二酮；12：2,3-戊二酮； 13：2-戊酮；14：2-戊酮；15：异戊醛；16：异戊醛；17：乙酸乙酯；18：乙酸乙酯；19：2-丁酮；20：2-丁酮；21：2,3-丁二酮；22：壬醛；23：己酸； 24：己酸；25：二甲基三硫；26：庚醛；27：亚硝基-二乙基胺；28：庚醛；29：糠醛；30：异丁酸；31：异戊醇；32：2-戊酮；33：2-戊酮；34：异丁醇； 35：异丁醇；36：2-丁酮；37：甲基丙醇；38：甲基丙醇；39：异丙醇；40：异丙醇；41：乙醇。下同。Fig.4 Comparison of GC-IMS of sea cucumber protein peptide powders1： 1-pentanol; 2: 1-pentanol; 3: benzaldehyde; 4: benzaldehyde; 5: 2-hexenol; 6: 2-hexenol; 7: hexanal; 8: hexanal; 9: hexanal; 10: hexanal;11: 2-3-pentanedione;12: 2-3-pentanedione; 13: 2-pentanone; 14: 2-pentanone; 15: 3-methylbutanal; 16: 3-methylbutanal; 17: ethyl acetate;18: ethyl acetate; 19: 2-butanone; 20: 2-butanone; 21: 2-3-butanedione; 22: n-Nonanal; 23: hexanoic acid; 24: hexanoic acid;25: dimethyl trisulfide; 26: heptanal; 27: N-nitrosodiethylamine; 28: heptanal; 29: furfural; 30: 2-methylpropanoic acid; 31: 3-methyl-1-butanol;32: 2-pentanone; 33: 2-pentanone; 34: 2-methylpropanol; 35: 2-methylpropanol; 36: 2-butanone; 37: methylpropanol; 38: methylpropanol;39: 2-propanol; 40: 2-propanol; 41: ethanol. The same below.