水产品中五氯酚及其钠盐的高效液相色谱串联质谱检测方法的优化

李诗言，王鼎南，周凡，柯庆青，贝亦江，吴洪喜，丁雪燕，王扬

(浙江省水产质量检测中心，杭州 310023)

五氯酚(pentachlorphenol,PCP)是一种氯代酚农药，曾作为高效的除草、杀虫和防腐试剂在世界范围内被广泛使用。20世纪60年代，为了预防吸血虫病，中国大量使用五氯酚及其钠盐用于消灭钉螺，近年来渔业养殖过程中也存在着非法使用五氯酚清塘等情况[1-2]。五氯酚具有强烈的遗传毒性和生理毒性，且化学性质稳定，已成为重点监控的环境污染物之一，被多个国家禁止使用[3-5]。中华人民共和国农业农村部早在2002年便发布公告[6]规定所有食品动物中不得检出五氯酚钠。五氯酚可在水生动物体内蓄积，带来的食品安全风险不容忽视，因此近年来水产品中五氯酚残留的监控有着加强的趋势。在国家市场监管总局发布最新的2019年食品安全监督抽检计划[7]中，大宗水产品均新增加了五氯酚钠(以五氯酚计)检测项目。

五氯酚及其钠盐常见的检测方法主要有气相色谱法(GC)[8-9]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[10-12]、液相色谱法(LC)[13]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[14-16]等。GC和GC-MS法需要衍生化，前处理操作繁琐；LC法基质干扰多，定性能力不足；LC-MS/MS法特异性强，灵敏度高，且前处理无需衍生，近年来已广泛应用在生物样品中五氯酚残留测定。目前LC-MS/MS分析水产品中五氯酚及其钠盐残留的标准方法是2016年发布的食品安全国家标准GB 23200.92—2016[17]，然而该方法存在着前处理耗时长，易受复杂基质干扰的问题。为此，本研究旨在建立水产品中五氯酚及其钠盐的高效液相色谱串联质谱检测方法，在标准方法的基础上，通过对色谱、质谱条件的优化以及样品前处理参数的改良，提升原方法的抗基质干扰能力，进一步提高方法的检测效率。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

主要实验仪器包括：1200系列液相色谱仪(美国Agilent公司)；4000 Qtrap 三重四级杆质谱仪(美国 SCIEX 公司)；Multi Reax全能型振荡器(德国 Heidolph 公司)；Allegra X-12高速离心机(美国 BECKMAN 公司)和N-EVAP112水浴式氮吹浓缩仪(美国Organomation Associates，Inc)。

标准物质包括：甲醇中五氯酚钠标准溶液(100 μg/mL，农业农村部环境保护科监测所)和13C6-五氯苯酚(1mg，First Standard)。

主要耗材及试剂包括：Oasis MAX固相萃取柱和MAX LP固相萃取柱(60 mg/3mL，美国Waters公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，美国TEDIA公司)；三乙胺、氨水(分析纯，上海麦克林生化试剂有限公司)；甲酸(色谱纯，美国ROE scientific INC.)和乙酸铵(色谱纯，美国Fisher公司)。

1.2 标准溶液的配制

取适量五氯酚及其同位素内标标准溶液储备液准确配制成质量浓度为1 mg/L的内标工作液以及质量浓度为0.1 mg/L的标准工作液，-20 ℃储存。

1.3 样品制备

样品采自浙江省某养殖场，品种包括南美白对虾(Penaeusvannamei)、中华绒螯蟹(EriocheirsinensisH.Milne-Edwards)和乌鳢(OphiocephalusargusCantor)。虾类样品去头去尾去壳后取肌肉组织，蟹类样品将主体躯干部分去壳去鳃后取可食部分，鱼类样品取肌肉组织，肉质样品均放入搅拌机中制为匀浆状，置于-20 ℃冻藏备用。

1.4 样品前处理

优化后样品前处理过程如下：准确称取均质样品2.00 g，置于50 mL带盖的离心管中，加入100 μL内标工作液，加入12 mL 70%(V/V)的乙腈水溶液(含5% 三乙胺，V/V)于离心管中，充分涡旋混匀5 min，以8 000 r/min高速离心5 min。将上述带基质样品提取液全部加于MAX LP柱(预先分别用3 mL甲醇和3 mL水润洗)，再依次用5 mL 5%氨水(V/V)溶液、5 mL甲醇以及5 mL 50%(V/V)的甲醇水溶液(含2% 甲酸，V/V)进行淋洗，弃去流出液，最后用5 mL的4%甲酸甲醇溶液洗脱，采用带刻度15 mL离心管收集洗脱液，并在40 ℃下氮吹至1 mL，用水定容至2 mL后过0.22 μm有机相滤膜，上机待测。未优化前处理过程参照标准GB 23200.92—2016[17]。

1.5 LC-MS/MS条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm×150.0 mm，3.5 μm)；流动相A为甲醇，流动相B为5 mmol/L乙酸铵水溶液；柱温为40 ℃；流速为0.3 mL/min；进样量为10 μL。梯度洗脱程序：0～3.0 min，60% B；3.0～6.0 min，60% ～2% B；6.0～8.0 min，2% B；8.0～8.1 min，2%～60% B；8.1～10min，60%B。

1.5.2 质谱条件

离子源模式为ESI-，离子源温度550 ℃，电喷雾电压-4 500 V，雾化气(GS1)压力345 kPa，辅助气(GS2)压力379 kPa，气帘气(CUR)压力172 kPa，扫描方式为多反应监测(MRM)模式，具体质谱参数见表1。

表1 目标化合物的质谱参数Tab.1 Mass spectrometric parameters for target compounds

注：*表示定量离子。—表示无。PCP为五氯酚(pentachlorophenol)，13C6-PCP为五氯酚-13C6(pentachlorophenol-13C6)。下同。

2 结果与讨论

2.1 标准方法检测结果分析

选用处理后的南美白对虾、中华绒毛蟹及乌鳢空白样品各5份，每份样品均加标5 μg/kg。采用GB 23200.92—2016标准方法进行测定，基质加标配置标曲，外标法定量，检测结果见表2。

结果显示，标准方法对于中华绒毛蟹样品的适用性较差，其中一个样品的加标回收率低于70.0%，且总体平均回收率为77.1%(RSD值为8.2%)，低于南美白对虾的84.0%(RSD值为3.2%)和乌鳢的83.2%(RSD值为3.7%)。实验中还发现，中华绒毛蟹基质含有蟹黄等油性物质，在MAX小柱上样过程中容易发生堵柱情况，通过加压或者真空反压可以缓解堵柱情况，但会影响小柱对目标化合物的保留性能，导致回收率下降。在标准方法附录C的不同基质五氯酚加标回收率汇总表中[17]，蟹类基质在1 μg/kg水平添加浓度时样品的回收率下限值仅为66.7%，表明标准方法对于蟹类基质适用性存在不足。

表2 使用GB 23200.92—2016标准方法测定水产品中五氯酚残留实验结果Tab.2 Determination of PCP in aquatic product samples by the standard method GB 23200.92—2016

此外，为了获取更好的质谱响应，标准方法采用“母离子找母离子”的MRM离子通道，但在本研究实际样品检测中发现，部分样品的离子对存在杂峰干扰，影响了检测的准确性。针对上述问题，本研究从前处理和仪器条件方面着手，对标准方法进行了系统优化。

2.2 检测方法优化

2.2.1 定量方式的优化

稳定同位素内标法是LC-MS/MS分析中校准基质效应的常见手段[18]，由于同位素内标与目标化合物理化性质非常接近，同时可进一步校准提取过程中的损失，因此定量稳定性与准确性通常要优于非同位素内标法。标准方法采用基质匹配标准曲线外标法定量五氯酚残留，由于不同种类样品基质效应存在差别，因此每个品种基质样品均要建立相应的基质标准曲线来校准基质效应。本研究选择13C6-PCP作为PCP的稳定同位素内标，通过内标法进行定量分析，采用纯试剂配制标准曲线，以简化实验。

2.2.2 质谱、色谱条件的优化

五氯酚为酸性化合物，含有羟基，因此采用负源进行分析，主要形成准分子离子峰[M-H]-。由于氯离子存在35Cl和37Cl两种同位素，含有5个氯离子的五氯酚能够形成具有不同质量数的同位素离子峰簇，因此标准方法选用m/z262.7、264.7、266.7和268.7 这4个同位素离子峰作为母离子，以4个母离子识别获得4个得分点，满足相关法规[19]对LC-MS/MS分析定性的点数要求。然而，质谱MRM扫描方式中的“母离子找母离子”模式相比“母离子找子离子”模式更易受到样品基质干扰。为此，本研究对五氯酚的二级质谱碎裂情况进行了考察，发现五氯苯酚的苯环结构比较稳定较难碎裂，4个同位素母离子主要二级碎片均为氯离子。通过质谱参数优化，选择碎片离子m/z35.1丰度最高的m/z262.7和m/z264.7作为母离子，以两个不同母离子分别找一个子离子的情况获得5个得分点。此时，目标化合物离子对通道基线较低，抗干扰能力强，优化后五氯酚及其同位素内标的MRM质谱参数见表1。

本研究考察了甲醇和乙腈流动相体系对五氯酚色谱行为的影响，结果表明，以甲醇作为有机相时，响应强度提升了近1倍，且水相中加入缓冲盐(乙酸铵水溶液)可有效改善目标化合物的峰形，因此，最终选择甲醇和乙酸铵水溶液作为流动相，与标准方法保持一致。此外，研究还发现出峰时流动相的高有机相比例能够提高五氯酚的响应强度，因此进一步优化了流速和梯度条件，使其出峰时间保持在98%的高有机相阶段。优化后的色谱条件见1.5.1节，五氯酚及其同位素内标的MRM色谱图见图1。

图1 五氯酚和13C6-五氯酚MRM色谱图Fig.1The extracted ion chromatography of pentachlorophenol (1 μg·L-1) and pentachlorophenol-13C6 (100 μg·L-1) under MRM mode

2.2.3 提取条件的优化

五氯酚作为酸性化合物，其pKa接近5，标准方法中后续净化采用阴离子交换小柱，要求上样溶液(提取溶液)为碱性溶液，使五氯酚成为离子态。因此，实验对比验证了不同碱性提取试剂在3种水产品基质中对五氯酚或其钠盐的单次提取效果(参照原标准以2 g样品，12 mL提取液进行测试)。结果表明，碱性乙腈的提取效果优于碱性甲醇，碱性试剂三乙胺的效果优于氨水，同时乙腈和水7∶3(V/V)配比后提取效果可进一步获得提升(表3)，其在南美白对虾、中华绒毛蟹和乌鳢试验中的平均提取率分别达到了84%、85%和87%。最终，本方法采用标准方法中的70%(V/V)的乙腈水溶液(含5% 三乙胺，V/V)作为提取试剂。研究还对提取试剂的提取次数进行了验证和优化，结果表明12 mL提取液均分后，分2次和3次提取后平均提取率仅能分别增加5%和7%，考虑到本方法采用同位素内标法进行定量，为了减少实验工作繁琐性，最终采用单次提取方式进行样品提取。

2.2.4 净化条件的优化

在碱性环境中五氯酚中的酚羟基能够与MAX小柱填料中的季铵基团发生离子交换作用，同时由于MAX小柱填料和五氯酚均具有苯环结构，在疏水作用力作用下进一步强化了五氯酚的保留，因此标准方法采用具有混合型阴离子交换能力的MAX小柱对五氯酚进行保留并净化。在SPE小柱净化过程中，标准方法依次通过氨水淋洗液清洗掉质谱兼容性较差的三乙胺溶液，甲醇淋洗液清洗掉仅靠疏水性吸附的杂质，用50%(V/V)的甲醇水溶液(含2%甲酸，V/V)清洗掉弱酸性干扰物，最后用4% 甲酸甲醇溶液对目标物进行洗脱。本研究对标准方法的淋洗和洗脱步骤进行了验证，发现4 mL的酸化甲醇洗脱液洗脱能力处于临界值附近，部分基质样品不能完全洗脱五氯酚，因此，在后续实验中增加了洗脱溶液的体积，提升至5 mL后五氯酚可完全洗脱。

表3 不同提取试剂的提取效率验证结果Tab.3 The results of extraction efficiency by different extraction reagents n=5

在2.1节标准方法验证工作中，研究发现蟹类基质在MAX小柱上会出现堵柱情况，为此选择填料粒径更大的MAX LP小柱作为实验材料来避免此问题的发生。MAX LP小柱填料粒径为60 μm，相比MAX小柱的30 μm粒径更适合黏稠样品检测，还可以获得更快的过柱流速，减少样品处理时间研究。以绝对回收率为参数，对比了MAX和MAX LP小柱的净化能力。结果表明，MAX LP小柱可以避免MAX小柱蟹类基质样品堵柱问题，并提升平均绝对回收率近10%，达到了74.2%，作为替代柱，其同样适用于南美白对虾和乌鳢基质(图2)。

图2 不同水产品基质中MAX和MAX LP小柱对 PCP净化效果对比(n=6)Fig.2Comparison of the PCP purification effects with MAX and MAX LP columns in different matrix of aquatic products(n=6)

2.3 方法学验证

2.3.1 方法的线性范围、回归方程与定量限

采用同位素内标稀释法，建立了6个浓度水平的系列梯度工作溶液，对目标物进行检测分析。五氯酚的定量离子对峰面积与相应同位素内标峰面积的比值(y)为纵坐标，以质量浓度(x，μg/L)为横坐标做内标定量工作曲线。五氯酚的线性方程为y=0.014 8x- 0.000 536，线性范围为0.5～50.0 μg/L，相关系数r为0. 999 2。采用标准添加法进行定量限(LOQ)和检出限(LOD)验证，以信噪比S/N大于3为本方法的LOD，信噪比S/N大于10为本方法的LOQ。优化后五氯酚在南美白对虾、乌鳢和中华绒毛蟹中的LOD值均为0.2 μg/kg；以0.5 μg/kg水平添加时，上述3种基质中五氯酚的信噪比S/N分别为25、19和21，可满足作为定量限的要求。

2.3.2 回收率和精密度

按1.4节前处理方法，取空白南美白对虾、乌鳢和中华绒毛蟹样品，做0.5、2.0和20.0 μg/kg 3个添加水平的加标回收试验，每个添加水平做6次平行测定，结果见表4。方法中五氯酚的平均回收率范围为92.4%～102.0%，RSD为3.21%～9.15%，说明优化后方法稳定、准确且可靠。

表4 优化方法在不同水产品基质中五氯酚的加标回收率和精密度Tab.4 The spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of pentachlorophenol in different aquatic products by the optimized method n=6

2.4 方法优化前后对比

研究比较了标准方法与优化后方法在仪器设备型号、进样量、定量限、基质效应、加标回收率和样品前处理所需时间等方面的数据。其中，基质效应实验中，取3种样品基质均值，计算公式如下：基质效应(%)=(基质空白溶液加标信号强度/空白溶剂加标信号强度)×100；加标回收率实验中，取3种基质各5批次样品结果均值；样品处理时间为单批次样品前处理所需时间。从表5可以看出，使用同型号质谱仪器、在进样量减半的情况下，优化后方法定量限从标准方法的1 μg/kg提高到了0.5 μg/kg，基质效应也从标准方法的16%控制到10%以内，平均加标回收率实验中，由于同位素稀释内标法的使用更是从标准方法的81%提高到了95%，单批次样品前处理所需时间也减少近1 h。可见优化后的方法成功解决了标准方法中中华绒毛蟹的适用性问题，同时进一步提升了方法的精密度和准确度。

表5 优化方法与GB 23200.92—2016方法比较结果Tab.5 Comparison results between the optimized method and GB 23200.92—2016 method

3 结论

相比于标准方法，本研究所建立的方法采用大粒径MAX LP小柱，避免了检测堵柱情况发生，显著地改善了标准方法对蟹类样品回收率偏低的问题，同时优化了质谱方法，减少了基质干扰。运用同位素稀释内标法定量，3种水产品基质中五氯酚加标回收率均达到90%以上，相对标准偏差均小于10%。经验证，本研究测定结果准确、可靠，可用于水产品中五氯酚及其钠盐的高效检测工作当中。