针康法通过抑制NF-кB信号通路对糖尿病脑卒中大鼠骨骼肌IRS-1mRNA、PI3KmRNA的表达影响

孙妲男 郑 剑 唐 强 李 勇*

（1 黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；2 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

糖尿病患者并发脑卒中已经成为糖尿病患者致残及致死的主要原因之一[1]，而现代康复医学对于糖尿病脑卒中发生后的神经功能障碍康复效果有限，我国学者创新性地将中医针灸头穴丛刺与康复疗法相结合，发明的针康法[2]目前已应用于临床并获得满意效果，但是其具体作用机制仍未阐明，本研究拟建立糖尿病脑卒中大鼠模型，探究针康法对糖尿病脑卒中大鼠骨骼肌NF-кB信号通路的抑制作用及其对IRS-1mRNA、PI3KmRNA的表达影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料：采用SPF级体质量190～210 g的健康雄性SD大鼠，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，本研究经学校伦理委员会通过。美国Moticam-3000 显微摄影成像系统；美国安捷伦MX3005P 荧光定量PCR仪。

1.2 模型制备：成年雄性SD大鼠高糖高脂饮食喂养4周后一次性腹腔注射现配2%的链脲佐菌素（35 mg/kg），糖尿病大鼠模型建立[3]。随后制备大鼠局灶性脑缺血模型，操作参照Longa改良线栓法[4]：用直径0.26 mm鱼线制作长约30 mm的栓线，于18 mm处标记，头端烧圆。大鼠禁食6 h后予10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）行腹腔注射麻醉。行颈部正中切口，小心分离出左侧颈内、外、总动脉，结扎颈外动脉主干及颈总动脉近心端，于颈总动脉远端置线，动脉夹夹闭颈总动脉分叉处，距分叉处以上0.4 mm行“V”形切口，栓线插入至标记刻度，避免进入翼腭动脉，使线栓越过大脑中动脉至大脑前动脉起始部，结扎备线，复位甲状腺并缝合切口。术后腹腔注射13 mL温生理盐水补充体液。假手术组除栓线10 min但不阻断血流外其余操作相同。

1.3 模型成功标准：链脲佐菌素给药7 d后非空腹血糖＞13.8 mmol/L且体质量＞250 g为糖尿病大鼠建模成功。造模术后6 h行改良Bederson神经功能评分，评分1～3分的大鼠提示造模成功。

1.4 实验分组实验过程中随机选取8只大鼠为空白组。除外造模过程中死亡及造模不成功的大鼠后将剩余40只大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺组、康复组、针康组等5组，每组各8只。

1.5 干预方法针刺组：造模24 h后予以头穴丛刺及背俞穴针刺，在百会穴及其两侧旁开4 mm处向前平刺至顶前区刺入深度0.5寸（150次/分），捻转1 min后留针1 h，2次/天。康复组：成模24 h后予以跑台训练，每日1次，每次20 min，速度逐步增加：前3 d 5 m/min，4～7 d 10 m/min，14～21 d 15 m/min。针康组予以上述2种干预措施。

1.6 按照免疫组化试剂盒说明书操作，应用病理图像分析系统（Imageproplus6.0）对大鼠骨骼肌NF-κB-p65蛋白阳性表达进行分析；根据标准RT-PCR流程进行操作，得出各组大鼠骨骼肌PI3KmRNA、IRS-1mRNA表达量。

1.7 统计分析方法：采用SPSS20.0统计软件处理实验数据，计量资料以均数±标准差表示，各组比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05，P＜0.05具有统计学差异。

2 实验结果

2.1 各组大鼠骨骼肌NF-кB-p65表达比较：与假手术组（7064.75±347.44）及模型组（7193.43±380.28）相比，针刺组（6359.63±367.40）、康复组（5997.44±206.20）、针康组（5611.26±446.48）NF-кB-p65光密度值均显著降低（P＜0.05）；与针刺组比较及康复组相比，针康组光密度值明显降低（P＜0.05）。

2.2 各组大鼠骨骼肌IRS-1mRNA、PI3KmRNA表达比较：与假手术组及模型组相比，干预组IRS-1mRNA与PI3K mRNA表达量均显著增加（P＜0.05），且与针刺组及康复组相比，针康组表达量增加更为显著（P＜0.05），见图1、2。

3 讨 论

糖尿病脑卒中已成为糖尿病最重要的致残原因之一，对人类健康造成极大威胁。本研究通过建立稳定且可靠的糖尿病大鼠模型，在此基础上建立脑卒中模型，能够很好地模拟临床糖尿病患者的病理生理过程。针康法是结合传统中医针刺疗法与现代康复技术的一种新型治疗方案，能够帮助脑血管意外患者快速康复，临床应用效果显著。

众多临床与基础研究证实，针刺疗法能有效改善脑卒中引起的肢体偏瘫并促进肢体神经功能恢复，头穴丛刺法是于致顺教授结合丰富临床经验和科学研究的基础上提出“头部透穴治疗脑血管病后瘫痪”的论点。该论点认为头穴丛刺法采取透经、透穴的理念，可以起到一经带多经以及一穴带多穴的作用。于教授认为[5]针刺头部区域可以产生一种“针场”，循经络传送至大脑皮质，对大脑皮质有明显刺激作用，进而改善脑神经细胞兴奋性，促进神经功能恢复。

图1 各组大鼠骨骼肌IRS-1mRNA表达

图2 2 各组大鼠骨骼肌PI3KmRNA表达

NF-кB信号通路是胰岛素抵抗和炎性反应过程中的重要一环，NF-кB活化后可以调节下游炎性因子的转录（如TNF-α、IL-1ß、IL-6等），而表达的炎性因子又正反馈使NF-кB进一步活化，形成“炎症瀑布效应”；研究发现[6]，胰岛素信号转导主要通过IRS/PI3K途径进行，若机体处于胰岛素抵抗状态，IRS/PI3K信号通过传导效率下降。本研究结果表明：与模型组相比，各干预组NF-кB-p65光密度值均明显降低（P＜0.05）；针康组光密度值较针刺组及康复组降低（P＜0.05），提示针康法可以降低骨骼肌的NF-κB表达，进而缓解由于高血糖引起的慢性炎症状态，改善骨骼肌胰岛素抵抗。本研究同时发现针康组大鼠骨骼肌中IRS-1mRNA与PI3KmRNA的表达量较针刺组和康复组均明显增加，表明针康法能够有效促进IRS/PI3K信号通路活化，从而表达更多IRS-1mRNA、PI3KmRNA以增强骨骼肌胰岛素敏感性，而这一作用可能与NF-кB信号通路受抑制密切相关。

综上所述，针康法可能通过抑制糖尿病脑卒中大鼠骨骼肌NF-кB信号通路来增加骨骼肌IRS-1mRNA、PI3KmRNA的表达，从而改善骨骼肌炎症状态及胰岛素抵抗状态，为今后的临床研究奠定理论基础。