酸性乳饮料专用型黄原胶的研究与制备

(山东阜丰发酵有限公司，山东 临沂 276600)

酸性乳饮料酸甜适中，爽滑可口，既具备了酸奶的特殊风味，又包含了酸奶的大部分营养成分和功能，且价格便宜，深受广大消费者的喜爱。为满足消费者对酸性乳饮料日益增长的需求，乳制品企业致力于开发形式多样的酸性乳饮料产品。但是由于酪蛋白在酸性乳饮料生产过程中易聚合，导致产品在贮存过程中发生分层、絮凝，带来蛋白质沉淀问题，影响产品品质[1]，给生产厂家带来很大的困扰，一直制约着酸性乳饮料产品的生产和开发。

添加稳定剂可以有效解决酸性乳饮料中蛋白质絮凝沉淀的问题。其中，应用最广泛的稳定剂是CMC[2]，单独使用CMC可以达到产品稳定的效果，但产品的口感和风味欠佳，加入黄原胶可以给产品带来更爽滑的口感，但黄原胶与CMC复配导致产品稳定性波动很大[3]，限制了黄原胶在酸性乳饮料行业中的应用。目前，尚未见通过改性黄原胶，使其与CMC复配使用得到稳定性好、口感好的酸性乳饮料的文献资料报道。笔者通过对复配稳定性好的酸性乳饮料专用型黄原胶(下称专用型)和普通黄原胶进行各项指标的检测，找到了二者之间的差别；通过改变发酵和提取工艺，达到对黄原胶进行改性处理的目的；得到的黄原胶与CMC复配应用于酸性乳饮料中，不会出现产品分层和絮凝沉淀的现象，使产品稳定性得到了很大的改善。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄原胶：市售普通型和专用型。分别编号为US-01，US-02，FR-01，FR-02，CN-01和CN-02。其中US为美国产，FR为法国产，CN为国产。US-01和FR-01为酸性乳饮料专用型黄原胶，其他为普通黄原胶。

菌种：甘蓝黑腐病黄单胞菌；KCl，NaOH，CaCO3和盐酸均购于天津恒兴化学试剂制造有限公司；食品级乙醇(体积分数为95%)、葡萄糖、脱脂奶粉、羧甲基纤维素钠(CMC)、山梨酸钾、柠檬酸均为市售普通食品和食品添加剂、加工助剂；蛋白胨、酵母粉、琼脂等购自国药集团。

1.2 仪器与设备

HPLC，美国安捷伦公司；原子吸收光谱仪，北京普析通用仪器有限公司；电子天平，梅特勒-托利多(METTLER TOLEDO)；pH计，上海雷磁科技有限公司；恒温培养箱、摇床：上海一恒仪器有限公司；Brookfield黏度计，美国Brookfield公司；立式压力蒸汽灭菌器、电热鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司；其他实验仪器购自蜀牛玻璃仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黄原胶特殊基团(丙酮酸和乙酰基)质量分数测定

丙酮酸质量分数的测定参考GB 1886.41—2015《食品安全国家标准 食品添加剂 黄原胶》中丙酮酸质量分数的测定方法；乙酰基质量分数的测定参考文献[4]中的方法；对黄原胶进行处理，获得试样进行液相分析。

1.3.2 金属离子含量测定

钾和钠离子质量分数的测定参照GB 5009.91—2017《食品安全国家标准 食品中钾、钠的测定》中第一法；镁离子质量分数的测定参照GB 5009.241—2017《食品安全国家标准 食品中镁的测定》中第一法；钙离子质量分数的测定参照GB 5009.92—2016《食品安全国家标准 食品中钙的测定》中第一法。

1.3.3 发酵条件的优化

将冷冻菌种活化后接入种子培养基培养20 h，按5%的接种量(体积分数)接入250 mL摇瓶中(瓶内加60 mL原始发酵培养基[5])，摇床转速250 r/min，30 ℃培养72 h。以原始发酵培养基为基础培养基，应用单因素优化方法，以发酵液产胶率(每千克发酵液获得的黄原胶干物质质量)、发酵液黏度、Ca2+质量分数为指标对CaCO3的添加量进行优化。CaCO3的添加量分别设定为0，0.1‰，0.2‰，0.3‰，0.4‰和0.5‰(以培养基计)。采用NaOH调节pH。

1.3.4 提取过程优化

采用乙醇沉淀的方式对黄原胶进行提取。因为需要在酸性环境下将丙酮酸去除，故在单因素实验中将条件假设为pH 4.0，温度40 ℃，时间2 h；保温完成后，将黄原胶倒出，加入1 000 mL乙醇，用NaOH溶液将pH调整为中性；对黄原胶进行沉淀后，将沉淀捞出，加入500 mL乙醇进行洗涤；洗涤完成后，得到纤维状黄原胶，将黄原胶烘干、粉碎、过80目筛。

1) 单因素实验

按照表1的水平对提取发酵液进行单因素实验，对获得产品按照1.3.1进行丙酮酸质量分数测定。

表1 单因素试验因素水平表Table 1 Single factor test level table

2) 正交实验

根据单因素实验的结果，对提取过程进行各因素进行正交优化，设计三因素三水平正交实验，如表2所示。

表2 三因素三水平正交实验表Table 2 Three-factor and three-level orthogonal test table

1.3.5 最终产品的验证

将获得的最终产品加入到酸性乳饮料的配方中。在做实际测试时，可以将黄原胶单独去除以测定CMC对酸性乳饮料稳定性的影响。酸性乳饮料样品制备好后，置于37 ℃培养箱内稳定1 d后，对产品进行离心沉淀测试。

离心沉淀测试：在产品贮藏1 d后，对产品进行离心沉淀测试。称取40 g样品到离心管中，常温下以5 000 r/min的转速旋转10 min，倒出上层液体，再将离心管倒置5 min后称重。每个样品进行3次平行测定，离心沉淀率取平行测定的平均值。

离心沉淀率的计算公式为

式中：m1为样品质量；m2为离心后沉淀的质量。

离心沉淀率越大时，产品越不稳定。一般认为产品离心沉降率在1%以内比较稳定，大于1%则不够稳定，该值越大产品越不稳定。

2 结果与分析

2.1 黄原胶特殊基团(丙酮酸和乙酰基)质量分数分析

在酸性乳饮料调酸过程中，当酪蛋白带负电荷较少时，酪蛋白就会和黄原胶发生络合作用，络合的强度受黄原胶的电荷密度及分子构象影响[3]。因此，不同来源黄原胶在产品中具有不同的电荷密度和分子构象，和酪蛋白络合的强度不同，从而使酸性乳饮料产品具有不同的稳定性。丙酮酸基团和乙酰基是黄原胶分子中的特殊基团，其质量分数显著影响黄原胶的溶液特性。其中，丙酮酸基团质量分数决定了黄原胶的电荷密度，且黄原胶中丙酮酸基团和乙酰基质量分数对黄原胶溶液的构象转变温度有一定的影响。实验中6种不同来源黄原胶的丙酮酸和乙酰基质量分数测试结果如表3所示。

表3 6种不同来源黄原胶丙酮酸和乙酰基质量分数

由表3可知：专用型黄原胶(US-01和FR-01)的丙酮酸质量分数在3.2%左右，而普通型黄原胶的丙酮酸均在4.9%以上。专用型黄原胶丙酮酸质量分数相较普通黄原胶低35%以上，两者的乙酰基质量分数相差不大，仅CN样品的乙酰基质量分数明显低于其他产品，可能是发酵条件和菌种不同造成的。因此可以认为丙酮酸质量分数是黄原胶影响酸性乳饮料稳定性的因素之一。

2.2 金属离子质量分数分析

在黄原胶的生物合成中，碳源和无机盐是影响黄原胶分子量最显著的因素[6]。主要通过在培养基中通过添加无机盐的方式来引入Ca2+，Mg2+，K+和Na+等离子，这些离子的引入会对产品的生物合成速率和终产品的性能(分子量、黏度和耐热性等)有较大的影响。其中，Ca2+可以作为聚合酶的促进因子，提高聚合酶的活性，从而提高黄原胶分子的聚合度和分子量[7-8]；Mg2+是多种激酶和合成酶的激活剂；K+和Na+则是黄单胞菌细胞膜上钠钾泵的组成成分，该泵对膜上离子的通透性有显著的影响，它有助于细胞中大分子物质的转运，既有助于将黄原胶生物合成的能量和前体物质葡萄糖转入胞内，也有助于将黄原胶的生物合成的前体物质转出胞外，从而对黄原胶的生物合成产生显著影响。6种不同来源黄原胶中Ca2+，Mg2+，K+和Na+质量分数测试结果如表4所示。

表4 6种不同来源黄原胶中Ca2+，Mg2+，K+和Na+质量分数测定结果

由表4可知：不同来源黄原胶中金属离子质量分数之间最大的差异是专用型黄原胶(US-01和FR-01)含有比较低的Ca2+和较高的Na+，其中Ca2+平均比其他产品低96.36%，Na+平均比其他产品高8.15倍，其它离子的质量分数很小。由此推测Ca2+残留可能会导致酸性乳饮料产品中酪蛋白的沉淀。因而不同来源黄原胶样品中Ca2+质量分数差异也许会导致酸性乳饮料产品具有不同的稳定性。而Na+和Ca2+质量分数成反比趋势，可能是采用含钠物质代替含钙物质作为解决发酵过程控制pH的方案造成的。

因此，笔者认为专用型黄原胶和普通型黄原胶的主要差异为专用型的Ca2+和丙酮酸质量分数与普通型的黄原有所区别。根据这些区别，可以在发酵提取过程中对Ca2+的添加量和丙酮酸脱除条件进行优化处理。

2.3 发酵条件的优化

在实际生产过程中，Ca2+的来源主要是在发酵过程中CaCO3的添加。在黄原胶发酵过程中，CaCO3不仅可以作为缓冲剂调节发酵过程中产品pH，防止pH下降过快，从而控制细胞的生长。因此生产过程中，可以在保证产量的前提下，通过发酵过程中减少CaCO3的添加量，达到减少Ca2+的目的。

其他因素不变，仅优化CaCO3的添加量(以发酵液质量计)，以产胶率、发酵液黏度、Ca2+含量为指标进行优化，结果如图1～3所示。

图1 不同CaCO3添加量与产胶率的关系Fig.1 Relationship between the amount of CaCO3 added and the amount of xanthan gum produced

图2 不同CaCO3添加量与发酵液黏度的关系Fig.2 The relationship between different CaCO3addition and fermentation broth viscosity

图3 不同CaCO3添加量与终产品中钙离子质量分数的关系Fig.3 Relationship between the amount of different CaCO3 added and the calciumion weight content of the final product

由图1～3可知：随着CaCO3添加量的增加，产胶率、发酵液黏度和Ca2+质量分数均有所提高，其中产胶率先增长，在CaCO3添加量为0.2‰时达到最大后平衡；而发酵液黏度在CaCO3添加量为0.2‰时达到最大增幅，然后缓慢爬升，可能的原因是随着Ca2+的添加，黄原胶分子之间缔合，使发酵液黏度增大。从Ca2+质量分数来看，在0.2‰添加量时，Ca2+质量分数为0.08%，符合前面提到的酸性乳饮料专用型黄原胶的0.09%左右的钙离子质量分数的要求。

2.4 提取过程优化

2.4.1 单因素实验

pH单因素实验：如图4所示，随着pH的下降，丙酮酸质量分数呈先下降后平稳的趋势，在pH 4.0时达到最低点，此时黄原胶中丙酮酸质量分数为3.92%。

图4 提取液pH对黄原胶中丙酮酸质量分数的影响Fig.4 Effect of extract pH on pyruvic acid weight content in xanthan gum

温度单因素实验：如图5所示，随着温度的升高，丙酮酸质量分数呈先下降后平稳的趋势，但下降幅度没有pH影响大。在60 ℃时达到最小值，此时黄原胶的丙酮酸质量分数为3.62%。

图5 提取液保温温度对黄原胶中丙酮酸质量分数的影响Fig.5 Effect of incubation temperature of extract on pyruvic acid weight content in xanthan gum

时间单因素实验：如图6所示，随着时间的延长，丙酮酸质量分数呈先下降后平稳的趋势，但下降幅度没有pH和温度影响大。在4 h时达到最小值，此时黄原胶的丙酮酸质量分数为3.49%。

图6 提取液保温时间对黄原胶中丙酮酸质量分数的影响Fig.6 Effect of incubation time of extract on pyruvateweight content in xanthan gum

通过以上单因素实验可以看出：pH，温度和时间三者与丙酮酸质量分数的下降均存在关联，但下降的程度不一，并且均没有达到检测要求的3.2%，因此对三者进行正交实验，继续优化实验条件。

2.4.2 正交实验

以丙酮酸质量分数为指标，对三因素三水平正交实验表进行数据处理，如表5所示。由表5可知：R(pH)>R(温度)>R(时间)，因此在变化的水平范围内，pH对结果的影响最大，其次是温度，而时间的影响最小。对于实验指标，丙酮酸的质量分数越小越好，因此由K值可知：K3(pH)

表5 以丙酮酸含量指标因素水平数据处理表

根据最优化实验方案，对该实验进行重复，结果基本一致。重复优化后，最终丙酮酸质量分数为3.12%，符合检测结果3.2%左右的要求。

2.5 终产品验证结果

通过离心沉淀率指标，可以看出酸性乳饮料中蛋白质的沉降情况。优化后的黄原胶样品加入酸性乳饮料的离心沉降率如表6所示。

表6 优化后黄原胶加入酸性乳饮料中离心沉淀率

由表6可知：优化后的产品离心沉淀率和仅加入CMC的样品相比明显降低，产品稳定性明显增强，同时优化后的产品离心沉淀率明显比专用型的样品要低。

3 结 论

酸性乳饮料是近年来发展比较迅速的饮料产品，但其含有的酪蛋白在酸性条件下极易絮凝沉淀，因此需要添加稳定剂。而黄原胶能给其带来良好的口感，由于黄原胶无法单独稳定体系，需要和CMC进行复配使用，不同的黄原胶产品复配后体系稳定性不同。通过对不同黄原胶的各项指标进行测定，找到了酸性乳饮料专用型黄原胶和普通型黄原胶的主要差异为专用型Ca2+质量分数和丙酮酸质量分数都低于普通型的黄原胶。通过发酵体系的单因素优化，寻找到了最佳的CaCO3添加量为0.2‰。通过在提取过程采用正交实验优化，在pH 3.5，温度70 ℃，时间4 h获得黄原胶丙酮酸质量分数为3.12%。最终加入改性黄原胶的酸性乳饮料，稳定性较好，使风味和稳定性均得到了保障。