利用甜菜碱提升赖氨酸发酵及其代谢通量分析

(廊坊梅花生物技术开发有限公司，河北 廊坊 065001)

赖氨酸是一种重要的氨基酸，大量用作营养强化剂和饲料添加剂[1]。目前全世界赖氨酸产量约220万t/年，市场规模约达到15亿美元[2]。鉴于赖氨酸巨大的市场价值，研究人员对赖氨酸的生物合成和发酵优化进行了大量研究[3-7]。大肠杆菌是一种重要的赖氨酸生产菌，它对渗透压较为敏感[8]。在大肠杆菌发酵赖氨酸的过程中，渗透压会超过2 000 mOsm，为了维持发酵后期菌体活性，必须通过添加甜菜碱来提高菌体对渗透压的耐受性[9-12]。然而，在单纯依赖甜菜碱的条件下，菌体已经无法很好地抵抗外界高渗透压环境。要提高菌体对外界高渗透压的耐受性，必须激发菌体其他的抗高渗透压机制。目前关于赖氨酸发酵渗透压调控方法未见报道。Ishida等[13]发现将大肠杆菌放在高渗透压条件下处理30 min，可以提高大肠杆菌在高渗透压条件下的生长速度，说明大肠杆菌在高渗透压条件下可以自发产生高渗透压耐受性；Sévin等[14]发现在高渗透压环境条件下，大肠杆菌会积累辅酶Q8，并证明了辅酶Q8可以提高大肠杆菌对渗透压的耐受性，其机制在于辅酶Q8的长异戊二烯侧链可以提高细胞壁强度。在一定的高渗透压条件下，细胞会失去水分，同时会积累海藻糖，而在向培养基中添加甜菜碱的条件下，细胞内的水分会恢复到正常水平，同时并未出现海藻糖的积累[15]。上述研究表明，大肠杆菌在高渗透压的条件下会发生一系列的生理变化，失去水分，菌体会通过吸收外界渗透压相容物(如甜菜碱)或提高细胞壁强度来提高菌体对环境高渗透压的耐受性。菌体在吸收甜菜碱后胞内水分会恢复到正常水平，此时菌体不需要调整代谢来适宜外界高渗透压环境，因而不会提高辅酶Q8或甜菜碱的合成来对抗外界高渗环境。

可以将菌体对高渗透压耐受分为两个主要机制：1) 吸收环境中的渗透压相容物；2) 菌体自身发生变化(合成渗透压相容物如海藻糖或提高细胞壁强度如合成辅酶Q8)，提高对外界高渗透压的耐受性。在机制1)条件下会削弱机制2)的形成，而提高细胞壁强度等措施只有在细胞分裂过程中才会生效，因而最合适的时机是在菌体快速生长阶段。笔者通过调整甜菜碱的添加时机，使菌体在发酵初期能经历较高渗透压环境，自身产生对渗透压的耐受性，在发酵后期可以吸收甜菜碱，获得进一步的渗透压耐受性。代谢通量分析是解析菌内微观代谢特点的重要方法[16]。通过代谢通量分析可以对底物代谢去向和比例进行定量分析，从而找到新的代谢靶点或者对上游代谢改造的结果进行确认。相较于酶活或者转录组学研究，代谢通量分析能更加直观地反映菌体的真实代谢情况[17]。主要通过发酵工艺的改进，改变甜菜碱的添加时机，使菌体本身产生渗透压耐受性，从而与吸收甜菜碱获得的渗透压耐受性相叠加，最终提高大肠杆菌对发酵过程中高渗透压的耐受性，使发酵强度和转化率有所提高。在得到高转化率工艺后，对其胞内代谢通量进行分析，发现了高转化率发酵过程的代谢特点。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

赖氨酸发酵菌种为基因工程改造的大肠杆菌，保存在本实验室中。

种子培养基(g/L)：淀粉水解糖30，玉米浆15，酵母粉40，硫酸铵10，磷酸氢二钾1，硫酸镁0.5，碳酸钙10，pH 7.0。

发酵培养基(g/L)：甜菜碱 2，葡萄糖30，糖蜜20，玉米浆20，硫酸铵30，磷酸氢二钾1，硫酸镁0.5。

1.2 渗透压测定

渗透压采用Osmomat basic 3000(德国gonotec)冰点渗透压仪进行测定。取2 mL样品转入离心管中，12 000 r/min离心2 min,取上清50 μL，转入1.5 mL EP管中，放入冰点渗透压仪中进行测定。

1.3 赖氨酸测定

高效液相色谱仪为Agilent 1200 HPLC (Agilent Technologies)；色谱柱为Kromasil C18(200×4.6 mm，5 μm)；流动相为V(乙腈)∶V(质量分数为0.5%的醋酸钠，用冰醋酸调节pH至6.8)=42∶58；检测波长为360 nm；流速为1 mL/min。

1.4 葡萄糖浓度测定

葡萄糖浓度采用生物传感分析仪(SBA-40C，山东省科学院生物研究所)进行测定。取样，稀释10倍后，取25 μL稀释液测定葡萄糖浓度。

1.5 菌浓测定

菌浓采用722E型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)测定。取1 mL样品，稀释50倍，在波长562 nm条件下测定样品OD562。

1.6 游离铵浓度测定

游离铵采用凯氏定氮仪进行测定。

1.7 赖氨酸发酵方法

赖氨酸发酵用百伦50 L发酵罐进行；接种量为10%(按体积分数计)；加入氨水，控制发酵pH为6.8±0.2；流加硫酸铵，控制游离铵质量浓度为1±0.1 g/L；流加葡萄糖，控制发酵过程中糖的质量浓度为2～4 g/L；通过调整通气量和搅拌转速使得发酵过程中溶氧>30%；发酵温度为37 ℃。

1.8 代谢通量分析

研究所采用的代谢通量分析基于化学计量的方法进行。代谢通量分析过程中所用代谢网络如表1所示。该代谢网络由糖酵解途径、磷酸戊糖途径、TCA循环、赖氨酸合成反应和能量代谢反应等23个代谢反应组成，其中r1～r19为速率未知的代谢反应，r20～r23是经过测定的已知代谢速率的反应。

表1 大肠杆菌产赖氨酸代谢反应网络Table 1 Reaction network of E. coli producing lysine

基于表1中的代谢网络，由19个中间代谢物通过化学计量平衡得到的化学计量矩阵如表2所示，该矩阵每一行代表一个代谢物的平衡式，每一列代表一个代谢反应，其中未知反应r1～r19构成的矩阵记作S，已知反应r20～r23构成的矩阵记作B，需要求解的代谢反应向量记作V，已知反应组成的列向量[r20,r21,r22,r23]T记作V0。根据化学计量守恒有S×V=(-B)×V0，利用矩阵除法可以计算出需求解的代谢反应向量V=S[(-B)×V0]。

2 结果与讨论

2.1 提高发酵液渗透压对赖氨酸发酵的影响

由于赖氨酸发酵后期的渗透压超过2 000 mOsm，这种高渗透压环境可能对菌体生长造成较大影响，这些渗透压的主要来源是赖氨酸。为了研究高渗透压对赖氨酸发酵的影响，在初始培养基中添加300 mmol的赖氨酸或氯化钠，观察不同类型的高渗透压来源是否带来相同的影响，以考察高渗透压是否是后期发酵效率下降的主要因素。

初始培养基中添加赖氨酸或氯化钠对发酵的影响如图1所示。在赖氨酸发酵过程中，初始渗透压为718 mOsm，发酵前期，由于葡萄糖等成分的浓度不断下降，导致渗透压不断下降；发酵中后期，随着赖氨酸等的浓度不断提高，渗透压会不断升高，最终到达2 350 mOsm。在初始培养基中添加300 mmol的赖氨酸后，虽然前期发酵液中赖氨酸质量浓度比对照组高(0 h，对照赖氨酸6 g/L，添加赖氨酸的组赖氨酸61 g/L)，但是12 h后与对照组的赖氨酸质量浓度差越来越小，36 h放罐时的赖氨酸质量浓度甚至略低于对照组，如图1(a)所示。培养基中添加赖氨酸后，初始渗透压比对照高，而到放罐时，其渗透压比对照略低，如图1(b)所示，对照组2 350 mOsm，添加赖氨酸组2 312 mOsm。实验结果说明：通过添加赖氨酸来提高发酵液中渗透压强度后，对发酵前期影响较小，菌体对中等浓度的渗透压有一定的耐受能力，而到发酵后期菌体无法耐受太高的渗透压，导致赖氨酸合成的速度越来越慢，最终在添加赖氨酸的实验组的赖氨酸浓度较对照偏低。

表2 大肠杆菌产赖氨酸代谢网络中代谢物化学计量平衡矩阵Table 2 The stoichiometric matrix of the metabolic network of E. coli producing lysine

由于赖氨酸本身也有可能抑制赖氨酸的合成，为了验证上述抑制作用主要是来自渗透压，笔者在另一个发酵罐的初始培养基中添加了300 mmol 氯化钠。添加氯化钠后，发酵过程中渗透压变化趋势与添加赖氨酸的实验组基本相同，见图1(b)；而赖氨酸质量浓度在发酵前期与对照组相当，发酵后期比对照组低。在赖氨酸发酵过程中，无论是添加赖氨酸或者氯化钠，提高发酵液渗透压的措施后，发酵后期的发酵液的渗透压都趋近2 300 mOsm，说明菌体难以在更高的渗透压条件下继续高效合成赖氨酸，无法继续提高发酵液中赖氨酸的质量浓度。

图1 初始培养基中添加赖氨酸或氯化钠对发酵的影响Fig.1 Effect of adding lysine or NaCl on lysine fermentation

2.2 甜菜碱添加时机对赖氨酸发酵的影响

大肠杆菌对渗透压的耐受性主要来自两个方面：1) 吸收环境中渗透压相容物；2) 提高自身渗透压耐受性。若这两种功能可以同时发挥作用则可以进一步提高菌体对高渗透压的耐受性。赖氨酸发酵前期(即菌体的生长阶段)发酵液中的渗透压较低，发酵后期渗透压则会很高。大肠杆菌在生长阶段通过提高细胞壁的强度可以提高对渗透压的耐受性，而当初始培养基中含有渗透压相容物后，菌体就不会自发提高细胞壁强度。要在赖氨酸发酵过程中进一步提高渗透压耐受性，应该将底料中的甜菜碱除去，保证菌体在生长阶段无法吸收甜菜碱，从而自发提高细胞壁强度；到稳定期后再将甜菜碱投入发酵罐中，这样大肠杆菌就能拥有两种提高耐受渗透压的方式，从而更好地抵抗后期渗透压的影响。

除去底料中的甜菜碱，然后在不同批次的赖氨酸发酵过程中OD562分别达到9.7，19.5和30.1时将等量的甜菜碱倒入发酵罐中，观察不同甜菜碱添加时机对赖氨酸发酵的影响，对照组的甜菜碱在底料中添加，如图2所示。在正常发酵过程中(对照组)，菌体OD562在10 h前快速生长，10～20 h菌体生长速度变慢，20～28 h菌体浓度趋于稳定，28～36 h菌体浓度略有下降。当在菌体OD562分别为9.7，19.5，30.1时，添加甜菜碱，添加甜菜碱前，菌体OD562比对照组略低，添加甜菜碱后，菌体OD562开始快速增长，36 h时菌体OD562均比对照组高，在菌体生长到OD562越高的时候添加甜菜碱则下罐OD562越高。上述结果表明，在菌体生长到一定程度后再添加甜菜碱可以促使菌体形成对渗透压的耐受性，进而促进菌体的生长，并提高后期菌体OD562。

图2 在菌体生长到不同OD562条件下 添加甜菜碱对生长的影响Fig.2 Effect of adding betaine at different OD562 on cell growth

推迟添加甜菜碱，除了能促进菌体生长，还能提高发酵强度。在不同OD562时添加甜菜碱，能提高下罐赖氨酸的浓度，OD562为9.7，19.5和30.1时添加甜菜碱，下罐赖氨酸质量浓度分别为171，177，185 g/L，添加甜菜碱的时候OD562越大，下罐赖氨酸质量浓度越高，同时菌体耐受的渗透压也越高，分别为2 380，2 410，2 490 mOsm(见表3)。推迟添加甜菜碱使发酵强度较对照组有了较大提高，如表3所示，OD562为9.7，19.5和30.1时添加甜菜碱，对应发酵强度分别较对照组提高了3.6%，8.9%和12.5%，说明推迟添加甜菜碱可以有效提高菌体活力，从而提高赖氨酸的生产效率。

表3 在菌体生长到不同OD562时添加甜菜碱后的发酵结果Table 3 Fermentation results after adding betaine at different OD562

在不同OD562时添加甜菜碱不仅能够提高菌体生长速度和发酵强度，还能提高发酵转化率，如表3所示。在OD562为 9.7，19.5，30.1时添加甜菜碱，转化率分别较对照组提升了2.4%，3.5%，3%；在OD562为19.5时添加甜菜碱时的转化率最高；继续提高OD562至30.1后，转化率反而开始降低，这可能是因为当继续提高添加甜菜碱时的OD562值后菌体最终生长的OD562过高，反而需要消耗更多能量用于菌体生长和维持，如图2。因此，从转化率的角度看，最佳甜菜碱添加时机是OD562为19.5时。

2.3 提高发酵初期渗透压对赖氨酸发酵的影响

在2.2中，通过除去底料里的甜菜碱并在OD562生长到一定阶段后再将等量甜菜碱投入发酵罐中，成功提高了发酵强度和转化率，实验结果与预期基本相符，在一定程度上证明了在菌体生长初期除去甜菜碱可以使得菌体获得对渗透压的耐受性。既然在没有甜菜碱的条件下，菌体在生长过程中可以获得渗透压耐受性，那么提高初期发酵液的渗透压强度可能使得菌体对渗透压的耐受性进一步强化。在2.3中，移除发酵底料中的甜菜碱，然后在OD562生长到20左右，将甜菜碱倒入发酵液中，接着提高发酵0 h时葡萄糖质量浓度(见图3(a))，提高发酵初期的渗透压强度(见图3(b))，观察提高发酵初期渗透压强度对赖氨酸发酵的影响。

除去底料中甜菜碱后(OD562到20左右将甜菜碱倒入发酵罐)，将初糖质量浓度从30 g/L提高到40 g/L，8 h之前OD562会略微降低，发酵12 h后，OD562比对照组高，下罐时OD562也高于对照组，见图3(c)；同时，36 h时发酵液中的赖氨酸质量浓度从177 g/L提高到185 g/L，见图3(d)，发酵强度从6.1 g/L/h提高到6.6 g/(L·h)，见表4。然而，提高初糖质量浓度后，转化率从68.5%下降到67.5%，这可能是提高了菌体OD562后增加了能量消耗造成的。

图3 提高初糖浓度对赖氨酸发酵的影响Fig.3 Effect of increase initial glucose concentration on lysine fermentation

目前，国内已报道的大肠杆菌发酵产赖氨酸的最高转化率为70%，最高赖氨酸质量浓度为194.4 g/L[18]。由于菌株存在差异，本实验中采用的菌株培养36 h即可下罐，虽然最终赖氨酸质量浓度比国内最高水平(194.4 g/L，48 h)略低，但是发酵效率却高得多。

表4 提高初糖质量浓度对赖氨酸发酵的影响

2.4 赖氨酸高转化率条件下代谢通量分析

赖氨酸属于大宗氨基酸，全世界年产量高达220万t。随着市场的饱和，对大部分生产厂家而言转化率是影响生产成本的最关键的因素，为了分析在高转化率的赖氨酸发酵过程中大肠杆菌的代谢特点，笔者计算了高转化率工艺条件下大肠杆菌的胞内代谢通量，并与对照组进行比较。

当OD562达到19.5时向培养基中加入甜菜碱可以将转化率由对照组的65%提升至68.5%(为笔者本次研究中的最高转化率)，实验组与对照组胞内代谢通量分析结果见图4，图中代谢反应旁的数字为相对代谢通量，其中葡萄糖吸收速率设定为100，其他速率根据与葡萄糖吸收速率的关系归一化得到。虽然无法利用代谢通量分析发现甜菜碱在赖氨酸发酵过程中的作用，但是通过高/低转化率发酵条件下代谢通量的比较仍然可以分析赖氨酸发酵过程中微观代谢的特点，从而找到影响转化率的关键因素，为高转化率菌株的代谢改造指明方向。

图4 高/低转化率条件下大肠杆菌相对代谢通量分布Fig.4 Relative metabolic flux distribution of E. coli under high/low yield

赖氨酸发酵过程中反应r2(6-磷酸葡萄糖→6-磷酸果糖)的代谢通量数值为负数，说明该反应的代谢方向与定义方向相反，即由磷酸戊糖途径产生的6-磷酸果糖会逆流生成6-磷酸葡萄糖，并再次进入磷酸戊糖途径。由于赖氨酸合成过程中需要消耗4个NADPH，而磷酸戊糖途径是NADPH的主要来源，r2代谢流方向与正常糖酵解途径方向相反是赖氨酸发酵过程中的一个重要特征。果糖吸收后会生成1, 6-二磷酸果糖，无法通过该反应进入磷酸戊糖途径，因此确保葡萄糖原料在发酵前不转化成果糖是保证赖氨酸高转化率的条件之一。可以看出，高转化率条件下，r2的代谢通量较对照组提高了43%，因此通过提高反应r2来提高磷酸戊糖途径的通量比例是高转化率的关键之一。

赖氨酸发酵过程中另一个特点是TCA循环通量较低，见图4。赖氨酸发酵过程中，由于大量丙酮酸被用作赖氨酸合成的前体，只能产生较少的乙酰辅酶A进入TCA循环，最终限制了TCA循环的通量。而高转化率条件下TCA循环较对照组降低了18.6%(见图4，r11：柠檬酸→α-酮戊二酸)。上述现象说明要保证赖氨酸发酵的高转化率必须降低TCA循环的通量，同时还要保证TCA循环有一定的活性以确保菌体的正常生长。如果能够设计出一种在生长结束后大大降低TCA循环通量的生物组件，必然能够极大提高赖氨酸发酵的转化率。

3 结 论

主要研究了赖氨酸发酵过程中渗透压对赖氨酸生产的影响，并通过调整菌体对渗透压的耐受性来提高发酵强度(从5.6 g/(L·h)提升至6.6 g/(L·h))和转化率(从65%提升至68.5%)。首先，在发酵0 h时添加赖氨酸或者氯化钠的实验结果表明高渗透压会在一定程度上抑制赖氨酸的合成。然后，在不同OD562条件下添加甜菜碱的实验表明改变甜菜碱的添加时机可以改善菌体对渗透压的耐受性，当OD562为19.5时添加甜菜碱可以较对照组提高1.5%的转化率。为了进一步提高发酵指标，通过提高发酵0 h时糖的质量浓度来提高初始渗透压。结果表明：提高发酵初期渗透压有利于提高菌体对后期高渗透压的耐受性，有利于提升发酵强度(从6.1 g/(L·h)提高至6.6 g/(L·h))，然而，由于菌体质量浓度的提高，最终转化率略有下降。最后，为探索高转化率条件下大肠杆菌的代谢特点，对高转化率发酵条件下菌体胞内代谢进行了代谢通量分析，发现6-磷酸果糖的逆向转化和低的TCA循环通量是赖氨酸高转化率的关键因素。