腺苷的主要功能和发酵法生产研究进展

(安徽工程大学 生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000)

腺苷是一种遍布人体细胞的内源性嘌呤核苷物质[1]，以其扩充血管的功能被人们熟知，自1909年有研究者[2]从苦味酸盐中提取出腺苷以后，其合成方法和应用领域就得到了广泛的研究。笔者将系统地讲述腺苷的功能和发酵合成，并详细介绍腺苷发酵法生产的代谢途径、育种思路及存在的主要问题。

1 腺苷的主要功能

1.1 作为重要中间体

腺苷可以以ATP和ADP形式进行能量传递，以环磷酸腺苷(cAMP)形式进行信号的传导，也可以以cAMP作为第二信使来参与细胞癌变、增殖和反转录等一系列过程[1-2]。

此外，腺苷还能用于阿糖腺苷和腺嘌呤核苷酸衍生物的合成，阿糖腺苷主要用于抑制DNA，RNA类病毒活性和抗单纯孢疹病毒。腺嘌呤核苷酸衍生物大多是抗菌素，如高瓜氨基腺苷、赖氨酰氨基腺苷、嘌呤霉素、腺苷乙硫氨酸、腺苷乙硫氨酸和S-腺苷蛋氨酸(SAM)等，嘌呤霉素与氨基酰tRNA结构相似，能与正在延伸的多肽链结合，结合后，多肽会以肽基嘌呤霉素的形式从核糖核蛋白体上解离，从而抑制蛋白质的合成。大多数SAM的生产和消耗在肝脏中进行，超过40种的代谢反应涉及到把甲基从SAM转移到各种底物上，如核酸、蛋白质、脂质和次生代谢产物，它们是多肽合成的抑制剂，有广谱抑菌的作用。

1.2 作用于心血管

腺苷作用于心血管时，主要副作用是导致室性早搏和短暂的窦性心动过缓[4]，因此有窦性心动过缓或房室阻病症的患者应慎用。腺苷在美国己经成为FDA批准的一种治疗阵发性室上性心动过速(PSVT)的一线药物，临床上可用于治疗急性心肌梗死，PSVT，心律失常和冠状动脉疾病等疾病。

腺苷可以促进血管扩张，因此可以防止血栓的形成[4]，还能调节肾上素的分泌和心脏房室信号的传导；也可以使细胞膜通透性降低，对皮内损伤的修复以及促进血小板的凝聚有一定作用[5]。

1.3 作用于大脑

腺苷可以用作抑制中枢神经系统的神经调节质，能够使大脑在能量的输出和输入过程中给出适当信号，让大脑的能量在两者之间保持平衡。

当大脑中血氧量不足时，糖原和葡萄糖快速分解产生的ATP可用于能量的输出，ATP降解后生成大量的腺苷，导致胞内的腺苷含量迅速上升，细胞膜的通透性会使腺苷被运送到细胞膜外，这时细胞外液中腺苷的释放就起到了调节作用[5]。当血氧逐渐恢复时，胞内的腺苷又可以合成ATP，这种调节使细胞的存活时间增长。

1.4 其他功能

腺苷能够降低肾素的分泌水平，减小肾血流量，降低肾小球的滤过率；对肺的作用包括收缩支气管、选择性降低肺动脉压和降低肺血管的阻力；在肝脏方面，腺苷能收缩肝脏血管，增加肝内糖原分解[6]；腺苷还能抑制机体脂肪分解，增加葡萄糖吸收；在腺苷影响免疫功能方面也有报道。

2 腺苷的生物合成

生物合成法主要有RNA降解和微生物发酵两 种方法。

2.1 RNA降解法

RNA降解法又可分为酵母RNA的化学水解、微生物RNA的自身酶解以及酵母RNA的微生物酶解[7]，其中酵母RNA酶解效率最理想。酵母RNA酶解具体步骤是：将培养好的酵母菌液离心、抽提、超滤，用RNA酶酶解得到4种单核苷酸的混合物，用离子交换树脂、亲和层析和密度梯度离心法等方法分离后得到磷酸腺苷，磷酸腺苷与5′-AMP反应脱磷酸化得到腺苷。

RNA降解法曾经是腺苷的主要生产方法，广东湛江、海南海口和福建莆田等地工厂曾用该方法生产腺苷，但该方法生产腺苷所使用的酶成本高、提纯工艺复杂且产量有限，目前已基本淘汰。

2.2 微生物发酵法

微生物发酵法生产腺苷是指利用物理或者化学方法处理出发菌株，改变其代谢路径或遗传标记，或者通过改善发酵条件、发酵培养基成分等来提高腺苷产量。发酵法生产腺苷的生产菌株有大肠杆菌、短小芽孢杆菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌。生产中常用枯草芽孢杆菌作为腺苷生产菌株。枯草芽孢杆菌是一种好氧的产芽孢型革兰氏阳性菌，易于分离和鉴定。大部分枯草芽孢杆菌菌株具有强烈的单磷酸降解酶系，因此常作为核苷类物质的生产菌[8]。

1930年Christman等[9]通过分解核酸得到腺苷后，腺苷的生产得到了广泛的研究。发酵法生产腺苷产苷量最高的是日本Haneda等[10]的研究，但是该方法中菌株退化严重，目前国外发酵法生产腺苷的研究鲜有报道。国内对腺苷的研究是近几十年才开始的，但研究进展较快。

2.2.1 枯草芽孢杆菌产苷途径

枯草芽孢杆菌生产嘌呤核苷酸的途径[11]有两条：全合成途径和补救途径。全合成途径也称作从头合成途径，是指通过一些简单的前体物质一步一步合成核苷酸；补救途径是指从培养基中获取嘌呤等物质来进一步合成嘌呤核苷酸的途径。

枯草芽孢杆菌利用葡萄糖(Glu)为碳源合成腺苷[12]全合成途径如下：

Glu经过戊糖磷酸途径(HMP)生成5-磷酸核糖(R5P)，R5P再经过11步反应才合成腺苷，其中5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)和肌苷酸(IMP)是所有嘌呤核苷酸合成的重要前体。IMP向下共有两条代谢途径，一条是IMP由腺苷琥珀酸合成酶催化合成腺苷琥珀酸(SAMP)，再经过腺苷琥珀酸裂解酶催化生成腺嘌呤核苷酸(AMP)，AMP经5-核苷酸酶作用生成腺苷；另一条途径是IMP通过肌苷酸脱氢酶催化生成黄嘌呤核苷酸(XMP)，XMP再经过鸟苷酸合成酶催化后生成鸟嘌呤核苷酸(GMP)，GMP分解为鸟苷(GR)。同时，AMP和GMP可分别通过腺苷酸脱氢酶和鸟苷酸还原酶的作用生成IMP。这3种核苷酸均可以在5-核苷酸酶的作用下脱磷酸形成核苷。

2.2.2 枯草芽孢杆菌产腺苷育种思想

菌种选育过程中可以根据其合成途径，有目的地进行代谢控制育种，可以用5个字进行概括，即进、通、节、堵和出。具体来说，是通过采取增加前体物质、消除自身反馈作用、切断代谢支流、解除相关酶的抑制作用和阻断产物的分解等手段，选育营养缺陷型突变株、渗漏型菌株和抗性菌株[13-14]或者关键酶缺失菌株，使能量和物质尽量多地通向目的产物。

产腺苷枯草芽孢杆菌代谢途径中可通过以下方法增强腺苷的合成：1) 外源加入PRPP和次黄嘌呤等前体物质；2) 选育黄嘌呤或鸟嘌呤营养缺陷型；3) 切断IMP向XMP的分支代谢通路；4) 降低腺苷酸脱氨酶活性；5) 选育抗腺苷结构类似物菌株。此外，改变细胞膜的通透性可以消除腺苷(酸)对琥珀酸腺苷酸合成酶的反馈抑制[15]，因此改变细胞膜的通透性也是一个不错的选择。

目前腺苷产菌菌株大多是经过化学或者物理诱变所得，再使用一般的诱变剂处理很难筛选出更高产量的菌株，所以今后研究者可以考虑使用新的诱变手段，提高诱变效率。

通过基因工程手段改善腺苷产生菌也有报道，任韶霞等[16-17]通过基因敲除提高了腺苷产量。基因敲除技术主要应用于两个方面：1)通过基因的功能分析，为改造提供直接有效的证据；2)应用于生物育种[18]上，基因敲除技术与代谢工程相结合，通过引入突变位点或阻断某种代谢支路，定向改变目的产物的质量和产量，也能增强细胞的遗传稳定性，从而达到生物育种的目的。

2.2.3 枯草芽孢杆菌产腺苷参数控制

生产菌株的选育和系统优化是腺苷发酵的关键，任何菌株都必须落实到反应器水平的发酵控制才能最终应用到实际生产中。国内发酵法生产腺苷的研究主要以具有单磷酸降解酶的肌苷产生菌枯草芽孢杆菌为出发菌株[7]，柏建新等[19]于2003年通过NTG和DES等诱变选育8-氮杂鸟嘌呤抗性突变株，摇瓶发酵产苷量达12.05 g/L；施庆珊等[20]在2005年对枯草芽孢杆菌HJ-9进行UV结合LiCl等诱变，得到8-氮黄嘌呤抗性菌株，摇瓶产量为16.3 g/L；王红连等[21]于2007年在22 L发酵罐中流加酵母膏和葡萄糖，其产量达18.2 g/L；2012年刘剑等[22]用50 L发酵罐控制溶氧(DO)，产苷量达20.1 g/L；2015年刘国生[13]采用N离子注入和DES诱变，得到腺苷高产菌株B.subtilisDI4-24，摇瓶产量高达16.37 g/L，500 L发酵罐放大，产苷量高达28.9 g/L。近年来通过基因工程手段[15-18]改善腺苷的研究也有所报导。2017年任韶霞等[17]以B.subtilisDI4-24的退化菌株B.subtilisDI4-24R为出发菌株，进行ARTP诱变处理得到B.subtilisAR-27，摇瓶产苷量达16.12 g/L。

除了优良的生产菌株，发酵条件的控制对腺苷的生产也至关重要[23]，甚至成为生产上影响产苷的主要因素。发酵生产主要控制点为培养基配比[23-24](碳氮源和无机盐)、温度、pH值、通气量[25]、转速、DO[22-25]和表面活性剂[26]等。

碳源和氮源是影响微生物生长和繁殖的重要因素。碳源主要影响菌株的生长，一般使用速效碳源葡萄糖提高菌株的生长速率，发酵过程中，当初糖质量浓度过高时，会导致底物抑制现象，不利于菌体的生长和产物的形成，流加葡萄糖是一种不错的选择。氮源[24]不仅影响菌株的生长还会对产苷周期产生作用。培养基中有多种氮源时，菌株会二次生长。腺苷发酵培养基中同时加入玉米浆、豆饼粉水解液和酵母粉。酵母粉属于迟效氮源，适量添加酵母粉可以延长产苷周期从而提高产苷量。温度主要影响酶活性和细胞膜的流动性。

pH除了影响酶活和细胞膜流动性还会影响细胞膜的通透性，从而影响某些物质的吸收和释放。产腺苷的枯草芽孢杆菌多属于好氧菌，但枯草芽孢杆菌的生长和产苷阶段的最佳需氧量不同，DO过高会导致发酵后期菌体活力降低，而DO过低会影响发酵前期菌体的生长，因此控制DO对提高腺苷产量至关重要[25]。有报道[22]称以DO为反馈指标，流加营养物质，当发酵液中底物消耗到一定范围时，细胞营养缺失，耗氧能力下降，导致DO迅速上升，但是，通过补加底物，细胞再次利用基质，DO又开始下降，通过这种方式可以维持DO在一个相对稳定的水平。王超明等[24]通过两阶段控制DO和pH，使腺苷产量明显增加，说明在菌株生长和生产阶段分别调节是很有效的。

高淑红等[26]研究了非离子表面活性剂Tween 80、阳离子表面活性剂CTAB和阴离子表面活性剂SDS对芽孢杆菌ATCC21616的腺苷合成和菌体生长的影响，发现表面活性剂对细菌生长影响的顺序是Tween 80

3 结 论

发酵法生产腺苷具有生产成本低、反应条件温和、原材料广泛等优点，但在生产中也存在一些瓶颈。发酵法产腺苷产量提高有限，高产菌株多次传代后，产腺苷性能极易下滑，主要原因是菌株的某些遗传标记不能够稳定传代，培养或保种条件的不当造成菌种回复突变，从而导致产量下降。打破腺苷生产中的瓶颈，腺苷的市场前景将会更美好。