茜草藤水提物对溃疡性结肠炎小鼠的作用*

张金玲，肖蒙，宋媛媛，贡雪芃，皮慧芳，李娟，杜光

(1.湖北科技学院药学院，咸宁 437100；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部，武汉 430030；3.华中科技大学同济医学院药学院，武汉 430030)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种累及回肠、直肠、结肠的特发性、慢性和复发性肠道炎症性疾病，包括克罗恩病(Crohn’s disease, CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)，多见于青壮年。临床表现为腹泻、腹痛、血便、体质量减轻等。IBD过去多见于西方发达国家，近年来,亚洲地区发病率呈上升趋势，流行病学研究显示我国炎症性肠病的发病率高达3.44%，居亚洲之首[1]。由于高复发性，患者常常会因反复的腹泻、腹痛、消化道出血、疲劳等不适症状，造成生活质量下降，同时持续的药物维持以及远期可能需要的外科干预让患者承担着严重的精神和经济负担，占用了大量的社会医疗资源[2]。ZHANG等[3]研究认为IBD是由遗传、环境、肠道菌群和免疫应答等多种因素相互作用所致。

茜草藤为茜草的地上部分，以茜草藤为主要成分的中成药制剂“儿泻停颗粒”用于小儿湿热内蕴型腹泻，临床效果良好[4]。有研究显示[5-6],茜草藤在UC中具有抗炎的疗效。除此之外，SUN等[7]研究显示茜草藤还具有抗病毒的药理作用。但是目前茜草藤在DSS诱导UC小鼠模型中是否具有预防结肠炎的作用笔者尚未见报道，因此本课题组实验研究茜草藤水提物预防UC的作用。报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性 C57BL /6J 小鼠 24 只，6～8 周龄，体质量(22±2)g，购自湖北省实验动物研究中心，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2015-0018。饲养于华中科技大学医学院附属同济医院动物房，动物饲养环境温度为 (22±2)℃，相对湿度为 (50±5)%。

1.2药物及试剂 茜草藤，2014年9月采于陕西省汉中地区，经华中科技大学同济医学院药学院张勇慧教授鉴定为茜草的地上部分，标本存放于华中科技大学同济医学院药学院，编号为：NP2014100703。葡聚糖硫酸钠(DSS)相对分子质量为35 000～50 000(美国MP公司，批号：160110)。小鼠白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(Elk biotechnology公司，批号分别为ELK1271，ELK1395，ELK1132)。

1.3仪器 酶标仪(Diatek公司，型号：DR-200Bs)，恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司，型号：GNP9160)，制冰机(常熟市雪科电器有限公司，型号：IMS-20)。

1.4实验分组 将 24 只 C57BL /6J 小鼠采用体质量分层随机数字表法分为空白对照组，模型对照组，茜草藤大、小剂量组，每组 6 只。

1.5茜草藤水提物的制备 称取粉碎后的茜草藤 1000 g，加水至没过药材，浸泡30 min，煎煮 1 h，将水煎液转移，再加水至没过药材，煎煮1 h，合并水煎液，静置 2 h，依次用脱脂棉、滤纸滤过。将滤过液置旋转蒸发仪中减压浓缩(温度65 ℃)，将浓缩至约1000 mL的水煎液放置-20 ℃冰箱保存，待用。

1.6造模方法及药物干预 茜草藤大、小剂量组分别预防性灌胃茜草藤提取物4.8，1.2 g·kg-1，预防性给予3 d，空白对照组和模型对照组灌胃等体积纯化水；模型对照组和茜草藤大、小剂量组分别给予3% DSS溶液造模，自由饮用，连续饮用 7 d，空白对照组小鼠给予纯化水饮用，直到实验第10天。小鼠灌胃药物，给药体积为20 mL·kg-1，每天1次，空白对照组小鼠给予纯化水。

1.7疾病活动度评分 造模前、造模后和给药后分别观察小鼠精神及活动状况, 每天记录小鼠体质量变化、大便性状及便血情况，计算疾病活动指数(disease activity index, DAI)。体质量变化 (%)=(造模后体质量-造模前体质量)/造模前体质量×100%。评分如下，①0分：体质量无变化，大便正常，无便血；②1分：体质量变化1%～5%，便软，成型，有便血点；③2分：体质量变化5%～10%，大便有黏液，成型，成块便血；④3分：体质量变化10%～15%，便软，有黏液，成型，成片的便血；⑤4分：体质量变化15%～20%，便软，有黏液，不成型，便血及肛门肿胀。

1.8样本采集 实验结束后，眼球取血，以3500 r·min-1离心10 min，取上层血清、分装，然后放置-80 ℃冰箱备用；剖腹后，摘取小鼠脾脏，测量脾脏长度及称定脾脏质量，脾脏指数=脾脏总质量(mg)/小鼠质量(g)；剪取距肛门以上2 cm 结肠，取病变最明显处结肠组织于4%多聚甲醛中，留作病理切片及免疫组化，再取结肠组织若干移至-80℃冰箱备用。

1.9苏木精-伊红(HE)染色检测 按常规包埋、切片，厚度为4 μm，进行HE染色，高倍显微镜下选取视野，根据溃疡大小、炎症浸润和结构损伤程度等进行结肠组织病变损伤程度统计和比较，组织学评分标准如下，①炎症反应严重程度，0分：无，1分：轻微的，2分：中等的，3分，严重的；②炎性反应范围，0分：无，1分：黏膜，2分：黏膜和黏膜下层，3分，透壁的；③隐窝破坏程度，0分：无，1分：1/3破坏，2分：2/3破坏，3分，隐窝消失伴上皮细胞出现，4分：隐窝及上皮细胞均消失[8]。

1.10ELISA 法检测小鼠血清中 IL-1β、组织中TNF-α、IFN-γ 含量 取小鼠血清及组织，血清直接用于检测。组织按照1：9比例加入0.9%氯化钠溶液，用电动匀浆器进行匀浆，然后 8000 r·min-1离心10 min，取上清液蛋白定量后按照TNF-α、IFN-γ ELISA试剂盒说明书进行操作并做检测。

1.11Toll样受体(TLR4)，髓样分化因子88(MYD88)表达 采用SP法，一抗稀释浓度分别为兔抗TLR4多克隆抗体1：1000，兔抗MYD88多克隆抗体1：400，二抗为HRP标记的山羊抗兔抗体1：200。

2 结果

2.1体质量变化 茜草藤对DSS诱导的UC小鼠的体质量影响见图1。空白对照组小鼠在实验期间体质量均上升，一般状态良好。小鼠饮用含3%DSS饮用水后，3组小鼠体质量均不同程度下降。实验第7天，与正常对照组比较，模型对照组体质量明显减少(P<0.01)，模型对照组在实验第7～10天体质量均下降，且第9和第10天下降最明显。茜草藤大、小剂量组体质量均较模型对照组偏高，第8天，与模型对照组比较差异有统计学意义(均P<0.05)。

2.2DAI评分 茜草藤对DSS诱导的UC小鼠DAI评分见图2。空白对照组小鼠体质量有所增加，大便硬度适中，黑褐色，椭圆形，无稀便及血便，故其DAI评分主要是其体质量波动评分。模型对照组小鼠饮用3%DSS 4 d后，大便性状开始变化，先是成形大便，然后逐渐变为稀松大便，甚至是水样泻，第5天部分小鼠出现血便，DAI评分显著升高；茜草藤大、小剂量组小鼠在造模后也出现体质量降低、大便性状改变，以及腹泻、血便等症状，但症状明显比模型对照组轻。与空白对照组比较，模型对照组小鼠在第5天DAI评分均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)，茜草藤大、小剂量组DAI评分也升高，但造模后DAI评分均低于模型对照组，第6天DAI评分显著低于模型对照组(P<0.05)。

与空白对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.05。

与空白对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.05 。

2.3茜草藤水提物对小鼠结肠病理组织学的影响 小鼠结肠HE染色病理组织学变化见图3，4。空白对照组小鼠结肠黏膜结构完整，上皮细胞形态正常，固有膜内未见明显炎细胞浸润；与空白对照组比较，模型对照组小鼠可见结肠黏膜上皮细胞大量脱落形成溃疡，黏液分泌增加，固有膜充血水肿，伴大量淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞浸润，呈溃疡性炎症改变，病理学评分显著升高(P<0.01)；与模型对照组比较，茜草藤大、小剂量组小鼠结肠黏膜结构较完整且黏膜层细胞未脱落，黏膜上皮细胞仅见少量淋巴细胞浸润，病理学评分均降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

A.空白对照组；B.模型对照组；C.茜草藤大剂量组；D.茜草藤小剂量组。

2.4茜草藤水提物对血清炎症因子IL-1β 及结肠组织炎性因子TNF-α、IFN-γ 的影响 与空白对照组比较，模型对照组血清中IL-1β、结肠组织中TNF-α 含量显著上升(P<0.05)。与模型对照组比较，茜草藤大、小剂量组血清IL-1β、组织TNF-α 含量显著降低(P<0.05)；与模型对照组比较，空白对照组，茜草藤大、小剂量组组织中IFN-γ 水平均降低，差异无统计学意义，见图5。

A.空白对照组；B.模型对照组；C.茜草藤大剂量组；D.茜草藤小剂量组；与空白对照组比较, *1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.01。

2.5茜草藤水提物对UC小鼠结肠组织中 TLR4、MYD88表达的影响 空白对照组中TLR4结肠上皮及细胞质中可见较多蓝色细胞核，少量呈阳性表达的棕黄色；模型对照组中TLR4分布于结肠上皮及膜内侧细胞质中，可见较多呈强阳性的深棕色颜色；与模型对照组比较，茜草藤大、小剂量组TLR4表达降低。MYD88在空白对照组、模型对照组中呈低表达；与模型对照组比较，茜草藤大、小剂量组结肠黏膜及上皮细胞中呈深黄色阳性高表达，见图6,7。

3 讨论

UC是目前重点研究的一种慢性疾病，UC模型的建立是研究生理病理工作的第一步，目前常用于UC基础药物研究的造模方法为化学诱导法，其中DSS诱导的模型是最广泛使用的模型[8-10]。因此本课题组选择DSS诱导UC模型进行实验研究，以评价茜草藤水提物对UC的预防作用。

现代药理学认为TLR4/MYD88依赖途径在炎症反应中扮演重要角色，细菌释放的脂多糖激活TLR4，激活后的TLR4可与MYD88、TIRAP/MAL等信号途径传导，启动下游信号通路进而激活NF-κB，引起炎症递质IL-1β、TNF-α、IFN-γ 等大量释放，促进结肠黏膜的损伤。本课题组选择MYD88依赖性信号通路，以TLR4、MYD88、IL-1β、TNF-α、IFN-γ作为观察指标，通过ELISA检测IL-1β、TNF-α、IFN-γ 的表达水平，免疫组织化学检测TLR4、MYD88的表达。

本研究通过小鼠体内动物实验发现,在实验前3 d预防性给药期间，茜草藤大剂量组小鼠体质量下降比模型对照组更明显，在实验第6天后上升，但没有茜草藤小剂量组上升幅度明显，DAI评分也显示相同的趋势，茜草藤大剂量组在实验前3 dDAI评分升高，之后缓慢下降，可能是因为大剂量茜草藤对肠道具有刺激作用，使小鼠体质量下降，故而DAI评分也升高。在实验第4天给予小鼠3%DSS溶液以诱导UC模型，小鼠在饮用DSS后，体质量均不同程度地下降，出现明显的腹泻、血便情况，与空白对照组比较，模型对照组DAI评分显著升高。而预防性给予茜草藤水提物后，各组小鼠体质量、腹泻、血便症状明显改善，其DAI评分显著低于模型对照组。HE染色病理切片结果显示与空白对照组比较模型对照组小鼠结肠黏膜结构不完整，伴有上皮细胞大量脱落形成溃疡；与模型对照组比较茜草藤大、小剂量组小鼠结肠黏膜结构较完整，病理损伤有所改善。本研究并不是考察抗炎细胞因子与促炎细胞因子的失衡导致UC，所以只检测促炎细胞因子的水平，并未检测抗炎细胞因子的水平。ELISA结果显示，与模型对照组比较，茜草藤大、小剂量组血清中促炎细胞因子IL-1β、组织中TNF-α 水平均显著降低；与模型对照组比较，茜草藤大、小剂量组组织中 IFN-γ 水平均降低，无显著性差异。免疫组织化学结果显示与模型对照组比较，茜草藤大、小剂量组MYD88的阳性表达较高，推测其炎症可能并不是通过TLR4/MYD88信号通路传导。

A.空白对照组；B.模型对照组；C.茜草藤大剂量组；D.茜草藤小剂量组；与空白对照组比较, *1P<0.05；与模型对照组比较，*2P<0.05。

A.空白对照组；B.模型对照组；C.茜草藤大剂量组；D.茜草藤小剂量组。

A.空白对照组；B.模型对照组；C.茜草藤大剂量组；D.茜草藤小剂量组。