多指标综合评定肉豆蔻挥发油缓解慢性炎性疼痛的谱效关系

肖俊勇，李力，从仁怀，刘宏

(1.华中科技大学无限极现代制剂技术联合实验室，武汉 430075；2.武汉药明康德新药开发有限公司，武汉 430075；3.国家纳米药物工程技术研究中心，武汉 430075)

肉豆蔻是肉豆蔻科植物肉豆蔻(MyristicafragransHoutt.)的干燥种仁[1]，又称肉果、玉果，俗称肉蔻。主要产地有马来西亚、印度尼西亚等，我国海南、云南、广东等地亦有栽培，但因气候不适以及收益期长，国内市场肉豆蔻主要源于进口[2-3]。肉豆蔻种仁入药，可治虚泻冷痢、脘腹冷痛、呕吐、抗炎镇痛、抑菌、抗抑郁、抗癌以及降血糖血脂等[4]，外用可作寄生虫驱除剂，治疗风湿痛等。肉豆蔻主要活性成分为挥发油[5]，其挥发油中化学成分主要是单萜类和芳香类化合物。

中药谱效学是在中医药理论现代研究的基础上，以中药指纹图谱为基础，以效应及效应体学为主要内容，应用生物信息学方法，建立中药指纹图谱与中药质量疗效内在关系的一门学科[6]。中药成分复杂，对疾病的治疗往往是多种成分通过多靶点和多环节发挥整体作用，单一药效指标难以全面反映中药的药效信息[7]。因此，随着中药谱效学研究的逐渐深入，新的中药多维谱效关系研究方法和模式逐渐形成，即选择先进的分析手段对化学成分进行多维分析以及尽可能多的选择与疗效密切相关的多种药效指标探讨谱效关系。目前笔者尚未见肉豆蔻挥发油缓解慢性炎性疼痛谱效关系的报道，因此，笔者运用灰色关联度分析法对肉豆蔻挥发油缓解慢性炎性疼痛的谱效关系进行研究。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性SPF级Wistar大鼠132只，体质量150～200 g，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2015-0018，合格证编号No.42000600025917。

1.2材料 肉豆蔻挥发油(课题组前期提取分离获得的19个挥发油，S1-S19)，双氯芬酸钠(diclofenac sodium，DS，Aladdin公司，含量≥99%，批号：K1702042)；无水乙醇(含量≥99.7%，批号：20160928)，二甲苯(含量≥99.0%，批号：20160929)，包埋石蜡(批号：20170303)，中性树胶(批号：88000109)购于国药集团化学试剂有限公司；完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich公司)；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒，链霉亲和素-生物素复合物(streptavidin-biotin complex，SABC)免疫组织化学试剂盒，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒，环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)抗体，均购于武汉博士德生物工程有限公司；神经激肽-1受体(neurokinin-1 receptor ，NK-1R)抗体(Millipore公司)；大鼠P物质酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(Abbkine公司)。

1.3仪器 7890A-5975C型气质联用仪(Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS)(美国安捷伦科技有限公司)，HP-5MS气相毛细管柱(美国安捷伦科技有限公司)，ZH-200热刺痛仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)，ZH-ZZY足趾容积测量仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)，C2500-R-230V微型高速离心机(美国Labnet)，ICV-450电热恒温培养箱(日本ASONE)，Multiskan MK3全自动酶标仪(Thermo scientific)，RM2016病理切片机(德国Leica)，JK-6组织摊烤片机(武汉俊杰电子有限公司)，BX53显微镜[成贯仪器(上海)有限公司]。

1.4GC-MS检测方法 采用顶空进样方法：称取肉豆蔻挥发油0.5 g，置于10 mL专用顶空瓶中，采用CTC PAL自动进样器，80 ℃平衡15 min；GC条件：HP-5MS石英毛细管柱(50 m×0.25 mm，0.25 μm)，进样口温度250 ℃，载气：氦气，载气流速1 mL·min-1，进样量500 μL，分流比50：1。采用程序升温：初始温度40 ℃(保持2 min)，6 ℃·min-1升温速率升至240 ℃(保持2 min)；质谱(MS)条件：离子源EI源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV，倍增管电压：1.2 kV，接口温度280 ℃，质量范围50～550。

1.5肉豆蔻挥发油指纹图谱的建立及相似度分析 将19个肉豆蔻挥发油样品的GC-MS检测结果采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)进行分析。

1.6药效实验

1.6.1慢性炎性疼痛模型的建立 于Wistar大鼠右后肢足底中部皮下注射完全弗氏佐剂0.15 mL，建立慢性炎性疼痛模型。

1.6.2动物分组及给药 取大鼠132只，随机分成22组，每组6只，适应性喂养1周，分别为空白对照组(于大鼠右后肢足底中部皮下注射0.9%氯化钠溶液0.15 mL)、模型对照组、双氯芬酸钠组(双氯芬酸钠2.5 mg·kg-1)、模型+肉豆蔻挥发油组(19组，30 mg·kg-1)。空白对照组及模型对照组每天灌胃给予等体积0.9%氯化钠溶液，双氯芬酸钠组每天灌胃给予相应剂量的双氯芬酸钠，肉豆蔻挥发油组每天灌胃给予相应剂量的肉豆蔻挥发油。

1.6.3足趾肿胀程度 分别于第0，1，3，5，7，14，21，28天用足趾容积测量仪测定大鼠造模脚(右脚)脚掌的肿胀程度。

1.6.4辐射热痛觉阈值 分别于第0，1，3，5，7，14，21，28天用热刺痛仪测定大鼠造模脚(右脚)的辐射热痛觉阈值。

1.6.5NK-1R、COX-2检测 动物造模、分组及给药同“1.6.1”和“1.6.2”项，于第4周进行样本采集。解剖大鼠，取第 5 腰椎背根神经节，10%中性甲醛室温固定，制备石蜡切片。按SABC法免疫组织化学染色操作步骤进行 NK-1R、COX-2 的免疫组织化学染色，镜检，测定NK-1R、COX-2。

1.6.6P物质检测 动物造模、分组及给药同“1.6.1”和“1.6.2”项，于第4周进行样本采集。颈部取血，静置，离心(3500 r·min-1，5 min)，取上清液，-80 ℃保存，采用ELISA法检测血液中 P 物质含量。

1.7灰色关联度分析法分析谱效关系 根据灰色关联度算法，本文以19个肉豆蔻挥发油的26个共有特征峰作为比较数列(子序列)，构成26个子序列记为[Xi(k)]，以肉豆蔻挥发油样品药效学指标足趾肿胀程度、辐射热痛觉阈值、P物质、NK-1R和COX-2作为参考序列(母序列)记为[X0(k)]，计算[X0(k)]与[Xi(k)]的关联度并排序。

2 结果

2.1肉豆蔻挥发油指纹图谱的建立及相似度分析结果 分析得对照指纹图谱见图1，19个肉豆蔻挥发油指纹图谱见图2，相似度结果见表1，各特征共有峰的面积见表2。根据表1结果发现各样品之间两两比较相似度为0.008～0.999，其中S5、S6、S14和S18这4个样品与其他样品比较差异有统计学意义，相似度均小于0.700。19种肉豆蔻挥发油之间存在差异，可作为谱效分析的样品。根据肉豆蔻挥发油指纹图谱分析得26个特征共有峰，由表2可知，其峰面积之和均占各样品总峰面积的87.00%～99.98%，可较好代表该样品。

图1 肉豆蔻挥发油的对照指纹图谱

图2 肉豆蔻挥发油指纹图谱

表1 不同肉豆蔻挥发油相似度评价结果

表2 GC-MS指纹图谱共有峰峰面积

续表2 GC-MS指纹图谱共有峰峰面积

2.2足趾肿胀程度测量结果 大鼠造模脚(右脚)的肿胀程度结果见表3。由表3可知：右脚变化较为明显，与空白对照组比较，给药后第1天给予完全弗氏佐剂的大鼠均有明显肿胀；给药后第3天，模型对照组依然明显肿胀，而各给药组均有不同程度的缓解，其中S3、S4、S6、S7、S8、S15、S16和S19组消肿效果显著，均优于双氯芬酸钠组；给药后第5，7，14，21天模型对照组与各给药组具有不同程度的缓解；给药后第28天，各给药组缓解程度均优于模型对照组，其中S3和S4组消肿效果最好，19个肉豆蔻挥发油给药组中仅S2组消肿效果弱于双氯芬酸钠组，缓解程度顺序为S3≈S4>S6≈S9≈S19>S1>S7≈S18>S17>S14≈S13>S12>S5>S10>S8≈S16≈S11=S15>双氯芬酸钠>S2。

2.3辐射热痛觉阈值测量结果 大鼠造模脚(右脚)的热痛觉阈值结果见表4。由表4可知，与空白对照组比较，给药后第1天给予完全弗氏佐剂的大鼠的热痛觉阈值均明显降低；给药后第3天，模型对照组和各给药组的热痛觉阈值均有不同程度的回升，各给药组的回升程度均高于模型对照组，其中S5、S15、S18、S19和双氯芬酸钠组的热痛觉阈值回升程度显著。给药后第14，21天，各给药组热痛觉阈值回升程度均高于模型对照组，其中S4组缓解疼痛的效果显著。给药后第28天，除S17、S18组外其他各给药组热痛觉阈值回升程度均高于模型对照组，其中S4组缓解疼痛效果最好，19个肉豆蔻挥发油给药组中S1、S13、S19、S8、S9、S18和S17组缓解效果弱于双氯芬酸钠组，缓解顺序为S4>S6>S15≈S11>S7>S14>S16>S2>S5>S3>S10>S12≈双氯芬酸钠>S1≈S13>S19>S8>S9>模型对照>S18>S17。

表3 大鼠右脚肿胀程度

表4 大鼠右脚热痛觉阈值

2.4NK-1R、COX-2检测 大鼠第五腰椎背根神经节通过免疫组织化学染色法检测的NK-1R和COX-2的平均吸光度见表5。由表5可知，给药后第4周，各给药组间NK-1R和COX-2的表达量均出现不同程度的改变，通过比较分析可知，与空白对照组比较，模型对照组NK-1R表达量显著升高；与模型对照组比较，各给药组NK-1R表达量均有不同程度的降低，其中S5-S17组显著降低(P<0.01)；各给药组NK-1R表达量降低程度顺序为S13>S11>S7>S10>S8>S9>S15>S17>S12>S16>S14>空白对照>S6>S5>S19>S18>S2>S3=S4>S1>模型对照>双氯芬酸钠，19个肉豆蔻挥发油给药组NK-1R表达量降低程度均优于双氯芬酸钠组。与空白对照组比较，模型对照组COX-2表达量显著升高；与模型对照组比较，各给药组COX-2表达量均有不同程度的降低，其中S5、S7、S8、S12、S16和S17组显著降低(P<0.01)；各给药组COX-2表达量降低程度顺序为S5>S7>S16>S8>S12>S17>S18>空白对照>S13>S11>S3>S15>S9>S10>S6>S2>S4>S14>双氯芬酸钠>S19>S1>模型对照，19个肉豆蔻挥发油给药组中S19和S1组的COX-2表达量降低程度低于双氯芬酸钠组。

2.5P物质检测结果 大鼠血液中P物质的释放量结果见表5。由表5可知：给药后第4周，各给药组间P物质释放量均出现不同程度的改变，通过比较分析可知各给药组P物质释放量降低程度顺序为S6>S16>S14>S13>S19>S18>S12>S10>S11>S17>S8>DS>S15≈S2>S9>模型对照>S3>S4>S5>S1>S7，19个肉豆蔻挥发油给药组中S15、S2、S9、S3、S4、S5、S1和S7组的P物质释放量降低程度低于双氯芬酸钠组，S3、S4、S5、S1和S7的P物质释放量高于模型对照组。

2.6灰色关联度分析结果 关联度汇总结果见表6，关联序汇总结果见表7。由表6和表7可知，26个特征共有峰对各药效评价指标和总药效的关联度均大于0.6，其中关联度最高的前五位峰为6号峰>8号峰>9号峰>5号峰>12号峰，可见肉豆蔻挥发油缓解慢性炎性疼痛效果是其有效物质成分群共同作用的结果。

表5 NK-1R和COX-2的平均吸光度和血液中P物质

3 讨论

慢性炎性疼痛是全世界的重要健康问题之一，它严重影响着人们的生活质量，每年用于慢性炎性疼痛的治疗费用很大程度加重公共医疗的经济负担[8-9]。因此，如何有效地缓解慢性炎性疼痛是亟需解决的问题。用于慢性炎性疼痛治疗的药物主要有苯二氮类药物、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)拮抗剂、非甾体类抗炎药物和阿片类药物等[10-13]，这些药物有一定的缓解慢性炎性疼痛效果，但因其副作用而应用受到限制。越来越多的研究发现中草药是缓解和治疗慢性炎性疼痛的有效途径[14]，如肉豆蔻挥发油可通过抑制COX-2的表达和降低血液中P物质的释放来缓解完全弗氏佐剂所致慢性炎性疼痛[15]。背根神经节作为痛觉传导的初级神经元，近年来已成为疼痛治疗的重要研究靶点[16]。炎性递质COX-2、NK-1R和P物质等本身又是致痛物质，在炎症反应和疼痛传导过程中均产生重要作用。因此，本研究综合足趾肿胀程度、辐射热痛觉阈值、第五腰椎背根神经节中NK-1R、COX-2的表达以及血液中P物质的释放这5个指标对肉豆蔻挥发油的药效学进行评价。

表6 关联度汇总结果

目前，用于中药谱效学的分析方法主要有灰色关联度分析法、回归分析和相关分析等。采用灰色关联度分析法对肉豆蔻挥发油GC-MS指纹图谱和各药效评价指标以及总药效进行综合分析，此分析方法对数据要求较低，可分析小样本[17]。由于数列单位不同或量纲不同，在进行关联分析之前，需要对各数列进行无量纲化处理。本研究釆用均值化法对数据进行标准化处理，可尽量避免两端值的影响而造成的数据失真，降低无量纲化处理对结果的影响。

表4中第28天模型对照组与空白对照组和各给药组比较，均差异无统计学意义。可能是因为环境温度极低导致室温达不到恒温要求，从而影响大鼠脚底热痛觉阈值。因此，后期实验过程中应严格控制室温恒温。表5中各组之间P物质均差异无统计学意义，根据当时实验条件分析，可能与大鼠处死时环境温度过低，从而影响大鼠血液中P物质的释放和分布有关。

表7 关联序汇总结果

综上所述，不同的肉豆蔻挥发油对足趾肿胀、热痛、NK-1R表达、COX-2表达和P物质的释放均有不同程度的缓解，大部分肉豆蔻挥发油样品缓解慢性炎性疼痛的效果均优于模型对照组，说明肉豆蔻挥发油具有缓解慢性炎性疼痛的作用。肉豆蔻缓解慢性炎性疼痛作用是其有效物质成分群——26个特征共有峰代表的化学成分共同作用的结果，虽然各特征共有峰代表的化学成分与各药效评价指标和总药效的关联度大小不同，但都是肉豆蔻挥发油缓解慢性炎性疼痛的有效成分，其中与缓解慢性炎性疼痛关联度最高的前五位峰为6号峰>8号峰>9号峰>5号峰>12号峰。本研究为以有效成分为基础的中药材质量控制标准的建立提供了参考依据，后期可对肉豆蔻挥发油缓解慢性炎性疼痛谱效关系深入研究，对其有效物质成分群中的成分进行进一步分析鉴定。