盐酸丁螺环酮大鼠在体肠吸收特征*

王柯玉，牟雄军，林宁

(湖北中医药大学药学院，武汉 430065)

盐酸丁螺环酮(buspirone hydrochloride，BUS)为氮杂螺环癸烷二酮化合物，于1985年由德国Bristol-Myers上市，目前已在世界上很多国家广泛使用。该药物在临床上主要用于广泛性焦虑症，还适用于更年期综合征、抑郁症、注意力缺乏、精神分裂症等[1]。丁螺环酮作为新一代非苯二氮类抗焦虑药，几乎无依赖性与耐药性，能长期服用，且无镇静催眠作用，对认知无影响，被认为是较为理想的抗焦虑药[2]。

BUS生物半衰期约2.6 h，血药峰值浓度较低，目前市场上出售大多为普通片，其存在服药次数多、顺应性差、生物利用度较低等问题，因此开发BUS缓释、控释制剂具有临床应用价值[3]。目前关于BUS肠道吸收及其机制研究的报道较少，研究药物肠道吸收机制和吸收动力学对于指导口服药物的剂型设计，尤其对缓释、控释制剂的剂型设计具有重要意义。因此，本研究选用大鼠在体肠灌流法，采用高效液相色谱(HPLC)法测定循环灌流液中BUS浓度，考察药物在大鼠肠道的吸收动力学特征，为BUS的缓释、控释制剂的研究与设计提供生物药剂学依据[4]。

1 材料与仪器

1.1实验动物 斯泼累格·多雷(SD)大鼠，雄性，体质量(250±50)g，购自华中科技大学同济医学院动物实验中心，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2011-0009，实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2013-0072。动物饲养于湖北中医药大学实验动物中心，温度18～35 ℃，相对湿度45%～75%，适应性喂养1周后开始实验，手术前禁食12 h，自由饮水。

1.2试药 BUS原料药(上海玉博生物科技有限公司，批号：20150722，含量≥99.9%)；BUS对照品(原料药精制，批号：201610)；酚红(国药集团化学试剂有限公司，批号：20150424)；戊巴比妥钠(中国医药集团上海化学试剂公司，进口分装，批号：F20141216)；甲醇(色谱纯，TEDIA)；乙腈(色谱纯，TEDIA)；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

1.3仪器 戴安P680高效液相色谱仪(美国戴安)；UV-1800型紫外-可见分光光度计(日本岛津)；BP211D电子天平(德国赛多利斯天平有限公司，感量：0.01 mg)；HL-2恒流泵(上海沪西分析仪器厂)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)；SK2200H型超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1肠循环液中BUS的含量测定

2.1.1溶液的配制 K氏缓冲液的制备：称取氯化钙0.37 g、葡萄糖1.40 g，置烧杯中，用适量水溶解；再称取氯化钠7.8 g、氯化钾0.35 g、氯化镁0.22 g、碳酸氢钠1.37 g、磷酸二氢钠0.32 g，依次加入另一烧杯中溶解；二者混合并定容至1 000 mL，测得pH值为7.4。空白肠循环液的制备：将配置好K氏液经肠循环装置，以5.0 mL·min-1流速冲洗大鼠肠道约45 min，收集，滤过，即得空白肠循环液。对照品溶液的制备：精密称取BUS对照品适量，用空白肠循环液溶解并定容，配制成含BUS浓度为0.101 mg·mL-1的对照品溶液。供试品溶液的制备：精密称取BUS和酚红适量，用空白肠循环液溶解并定容，配制成BUS浓度为20.12 μg·mL-1，酚红浓度为20.07 μg·mL-1的混合供试品溶液。

2.1.2色谱条件 色谱柱：Agilent SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-1%甲酸(40：60)；检测波长：238 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。

2.1.3系统适应性实验 按照“2.1.2”项色谱条件，取对照品溶液、供试品溶液、空白肠循环液进样测定。结果见图1，BUS保留时间为6.33 min，样品液主峰保留时间与对照品一致；空白肠循环液在BUS出峰处无干扰；供试品的分离度不少于1.5，理论板数不少于5 000。

2.1.4线性关系与方法学考察 精 密量取BUS对照品溶液适量，配制成4.04，8.08，12.12，16.16，20.20，30.30 μg·mL-1系列浓度标准溶液，于上述色谱条件下分别进行HPLC测定；以峰面积(A)对BUS浓度(C，μg·mL-1)进行线性回归，得回归方程：A=0.049 9C+0.007 3(R2=0.999 1)；BUS在4.04～30.30 μg·mL-1浓度范围内峰面积与浓度的线性关系良好。精密度实验中日内RSD=0.52%(n=5)，日间RSD=0.84%(n=3)；稳定性实验中将BUS对照品溶液室温放置24 h，其峰面积RSD=1.54%(n=5)，说明在实验过程中，BUS稳定性良好；加样回收率实验中配置浓度为20.12 μg·mL-1的BUS标准溶液，分别加入相当于标准溶液含量80%，100%，120%的样品，测定BUS的浓度，其平均回收率为99.73%，RSD=1.12%(n=3)；均符合要求[5-7]。

1.盐酸丁螺环酮

2.2肠循环液中酚红浓度的测定

2.2.1测定方法 采用可见-紫外分光光度法测定肠循环液中酚红的浓度。在波长200～600 nm范围进行紫外扫描，酚红在558 nm处有最大吸收，其他成分在此处无吸收，对酚红无干扰，故在波长558 nm处测定酚红的吸光度(A值)。

2.2.2酚红标准曲线的制备 精密称取酚红适量，配制浓度为5.03，10.06，20.12，30.18，35.21 μg·mL-1的酚红系列标准溶液，分别取酚红标准溶液0.5 mL置于10 mL具塞试管中，加入0.2 mol·L-1氢氧化钠溶液 5 mL，摇匀，用孔径0.45 μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，以0.2 mol·L-1氢氧化钠溶液为空白，在波长558 nm处测定，以A值对酚红浓度(C，μg·mL-1)进行线性回归，标准曲线回归方程为：A=0.009 8C+0.038 1(R2=0.999 7)。结果表明，酚红在浓度范围5.03～35.21 μg·mL-1内有良好的线性关系[8]。精密度实验中日内RSD=0.43%(n=5)，日间RSD=0.75%(n=3)；稳定性实验中将酚红溶液室温放置24 h，其峰面积RSD=1.32%(n=5)，说明在实验过程中，酚红稳定性良好；加样回收率实验中配置浓度为20.07 μg·mL-1的酚红标准溶液，分别加入相当于标准溶液含量80%，100%，120%的样品，测定酚红的浓度，其平均回收率为99.52%，RSD=1.26%(n=3)；均符合要求。

2.3大鼠在体肠道吸收实验

2.3.1肠道吸收实验方法 大鼠禁食、正常饮水18～20 h；麻醉，背位固定在手术台上，沿腹中线剪开腹腔；选取所需肠段，两端剪口，插管扎紧；用预热至37 ℃的0.9%氯化钠溶液冲洗肠道，再通入空气排净0.9%氯化钠溶液[9]。先用BUS供试品溶液以5 mL·min-1的流速循环10 min，然后将流速调节为2.5 mL·min-1；分别于不同时间点从供试液中分别取2和0.5 mL作为BUS和酚红的待测液，随即补充同浓度酚红供试品溶液2.5 mL；按上述方法测定各时间点BUS峰面积值(采用外标法)和酚红吸光度值，按文献方法计算吸收速率常数(Ka)和吸收百分率(ρ)[10-11]。

2.3.2不同肠段对药物在体肠吸收的影响 将十二指肠、空肠、回肠及结肠作为考察肠段，取含BUS浓度为20.12 μg·mL-1、酚红浓度为20.07 μg·mL-1的供试品溶液。按“2.3.1”项下方法操作，于0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 h取样，计算吸收参数，结果见表1。对数据进行方差分析及两两间多重比较，结果显示不同肠段Ka差异有统计学意义(P<0.05)。各肠段吸收速率常数按十二指肠、空肠、回肠、结肠的顺序依次下降。十二指肠为药物最佳吸收部位，但药物在整个肠段均有一定吸收。

表1 盐酸丁螺环酮在大鼠各肠段吸收参数

2.3.3不同浓度对药物在体肠吸收的影响 选取全肠段为考察肠段，取含BUS浓度分别为10.06，20.12，30.18 μg·mL-1、酚红浓度为20.07 μg·mL-1的供试品溶液。按“2.3.1”项下方法操作，于0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 h取样，计算其吸收参数，结果见表2。对Ka进行配对t检验，结果表示在不同药物浓度下，吸收速率常数Ka差异无统计学意义(P>0.05)，表明浓度在10.06～30.18 μg·mL-1，药物的吸收量与浓度成正比，Ka无明显变化，无饱和吸附现象，符合Ficks扩散原理，提示BUS的小肠吸收为被动扩散的机制。

表2 不同浓度盐酸丁螺环酮小肠吸收实验结果

2.3.4pH值对药物在体肠吸收的影响 选取吸收速率常数最大的十二指肠，用pH值为5.4，6.8，7.4的K氏液分别配制含BUS浓度为20.12 μg·mL-1、酚红浓度为20.07 μg·mL-1的供试品溶液。按“2.3.1”项下方法操作，于0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 h取样，计算其吸收参数，结果见表3。对Ka进行配对t检验，结果表示在不同环境pH值下，吸收速率常数Ka差异无统计学意义(P>0.05)。说明在pH值5.4～7.4范围内，BUS的吸收不受介质pH值的影响。

表3 不同pH值下盐酸丁螺环酮小肠吸收实验结果

3 讨论

在体肠循环法研究大鼠肠道吸收情况，通常认为大鼠肠道不仅吸收药物，同时也可能吸收或排出水分，所以在循环时会导致供试品溶液体积的改变[12]。一般可在循环液中加入酚红，由于酚红为大分子络合物，较难被肠道所吸收，因此可通过酚红浓度的变化来对肠循环液体积进行校正，即得不同时刻的剩余药量[13]。

从实验结果可以看出，以循环液中BUS剩余药量的对数lgD对时间t作线性回归，所得相关系数r均大于0.9，线性关系较好，提示BUS在大鼠小肠的吸收符合表观一级动力学过程，吸收以被动扩散为主；且BUS的吸收不受药物浓度和pH值的影响；大鼠各肠段间药物的吸收速率常数差异有统计学意义，按十二指肠、空肠、回肠、结肠依次减小，但药物在整个肠段均有一定程度的吸收，提示盐酸丁螺环酮可以制备缓释、控释制剂[14-15]。