蛹虫草菌丝体液体发酵条件的优化研究
2019-10-11曲亮璠王祥河许勤虎史连生
刘 然 曲亮璠 王祥河 许勤虎 史连生
1（天津量信检验认证技术有限公司，天津 300462）2（天津市工业微生物研究所有限公司，天津 300462）3（天津实发中科百奥工业生物技术有限公司，天津 300462）
蛹虫草（Cordyceps militaris）营养价值丰富，高蛋白，低脂肪，维生素和矿物质含量较高，是药食同源性真菌，在我国分布广泛。蛹虫草与冬虫夏草的功效成分和药理作用类似，其中多糖类、虫草酸、虫草素、超氧化物歧化酶（SOD）等功能性物质具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫系统等功能，近年来逐渐成为国内外的研究热点。蛹虫草菌丝体液体发酵方法与传统的人工培养方法不同，具有速度快、周期短、产量高、条件易于控制等特点，是一种新的产业化途径，具有良好的商业价值和广阔的市场空间。液体培养基的组分和配比以及发酵过程中pH 值、接种量、转速、温度等各个条件的控制对微生物菌丝体的繁殖和代谢产物的累积有直接的联系。因此，若要提高蛹虫草菌丝体的产量，首先要筛选出适宜发酵的培养基组成，再对发酵的工艺条件进行优化。本文通过单因素、响应面试验，优化了蛹虫草液体发酵生产菌丝体的工艺，旨在为其工业化生产奠定理论基础，也为开发新的保健食品、寻找新的药食来源提供科学依据和新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
供试菌株蛹虫草（Cordyceps militaris），菌种编号：CICC 14013。
蔗糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1、维生素B12均为分析纯。
1.2 仪器与设备
METTLER AE200 分析天平；METTLER Seven Multi pH 计；苏州净化SW-CJ-2F 型双人双面净化工作台；日本三洋MLS-3750 高压灭菌锅；上海安亭GL-20G-II 高速冷冻离心机；博迅GZX-9146 MBE 数显鼓风干燥箱。
1.3 方法
1.3.1 蛹虫草液体发酵试验
1.3.1.1 液体种子的制备
斜面培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L。
液体种子培养基：蔗糖40 g/L，蛋白胨20 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁1 g/L。
采用500 mL 三角瓶用于液体种子培养，接入1 cm2的斜面菌种，摇床转速180 r/min，装液量为200 mL，温度22 ℃，培养5 d。
1.3.1.2 发酵单因素试验
发酵培养基：蔗糖40 g/L、蛋白胨30 g/L、硫酸镁1.5 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、维生素B1适量、维生素B12适量。选择常见的蛋白胨和酵母膏作为氮源，葡萄糖、蔗糖和麦芽糖作为碳源，筛选出最佳液体培养基成分；分别选取不同pH 值（5、6、7、8、9），不同发酵温度（19 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃），不同摇床转速（130 r/min、150 r/min、170 r/min、190 r/min、210 r/min），不同接种量（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%），不同装液量（60 mL、80 mL、100 mL、120 mL、140 mL），以蛹虫草发酵产物中的菌丝体生物量为指标，发酵过程中保证其他条件不变，摇床振荡培养6 d，进行单因素试验。
1.3.1.3 发酵响应面试验
在上述单因素试验结果的基础上，进行三因素三水平响应面优化试验，以获得最佳发酵条件和最大菌丝体产量。
1.3.2 菌丝体产量测定方法
发酵产物中菌丝体的产量采用细胞干重法测定，取发酵产物于6 000 r/min 冷冻离心20 min，弃去上清液，用蒸馏水将菌丝体洗净后，重复上述试验操作，将得到的菌丝体置于60 ℃干燥箱中烘干至恒重。菌丝体产量按下式计算：
式中：X——菌丝体生物量，g/L；
W——菌丝体干重，g；
V——取样体积，mL。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 蛹虫草发酵最适碳、氮源种类筛选
在液体培养发酵中，碳源是除水分外细胞生长需要量最多的营养物质，为蛹虫草生长、合成物质提供能量，约占细胞干重的50%。氮源的基本作用是为微生物生长过程中蛋白质以及核酸的合成提供原料。由于微生物种类不同，生理特性有所差异，所能利用的碳源、氮源品种亦不相同。采用常见的单糖、双糖、低聚糖分别与蛋白胨和酵母膏组合，以菌丝体产量为判断标准，筛选出蛹虫草发酵的最适碳氮源。不同碳源、氮源组合对蛹虫草发酵菌丝体产量的影响见表1。由表1 可知，碳源对蛹虫草菌丝体产量的影响高于氮源。当蔗糖被用作发酵碳源时，菌体的生长速度更快，产量更高，所得菌丝体生物量高于利用葡萄糖和麦芽糖发酵所得。这可能是因为蔗糖更适合蛹虫草生长，更容易被菌体细胞吸收和转化。此时以蔗糖- 蛋白胨为培养基的蛹虫草发酵6 d，生物量达到最大值，为25.2 g/L。
表1 不同碳源、氮源组合对蛹虫草发酵菌丝体产量的影响
2.1.2 温度对菌丝体产量的影响
蛹虫草菌丝体的合成和各种功效成分的累积是在菌体内各种酶的催化条件下进行的，而酶的活性与温度密切相关。为了达到菌丝体生长速率快、代谢速度高的目的，在发酵过程中对于温度的控制尤为重要。不同温度对蛹虫草发酵菌丝体产量的影响如图1 所示。
图1 不同温度对蛹虫草发酵菌丝体产量的影响
由图1 可知，蛹虫草菌丝体在19 ℃～31 ℃范围内均可生长。当温度处于19 ℃～25 ℃，菌丝体产量较为理想；温度高于28 ℃，菌体产量显著下降。当温度为22 ℃时，菌丝体产量达到最高，为25.0 g/L。温度过低、过高都会使菌体内酶的活力降低、蛋白质合成速度减慢，因此将蛹虫草的液体发酵温度定为22 ℃。
2.1.3 装液量对菌丝体产量的影响
装液量的多少可以反应出摇瓶中的通气量，从而影响菌体生长所需氧气的供给和发酵过程中废气的排放，发酵摇瓶内培养基装液量过高或过低，都不利于蛹虫草菌丝体的富集培养，影响发酵结果。不同装液量对蛹虫草发酵菌丝体产量的影响如图2所示。
由图2 可知，当发酵摇瓶的装液量为100 mL时，蛹虫草的生长情况最好，获得的菌丝体最多，此时菌丝体产量达到25.4 g/L。
2.1.4 pH 对菌丝体产量的影响
过高、过低的pH 值都会影响真菌体内多糖和蛋白质合成过程中相关酶的活性，不利于其菌体生长。不同pH 值对蛹虫草发酵菌丝体产量的影响如图3 所示。
由图3 可知，随pH 值在5～9 范围内变化，菌丝体的产量呈现先增大后减小的趋势，当pH 值为7 时，其产量达到最大值24.6 g/L。
图2 不同装液量对蛹虫草发酵菌丝体产量的影响
图3 不同pH 值对蛹虫草发酵菌丝体产量的影响
2.1.5 接种量对菌丝体产量的影响
通过接种，可以在蛹虫草发酵过程中为其提供生命力强、生长旺盛的种子。不同接种量对蛹虫草发酵菌丝体产量的影响如图4 所示。
图4 不同接种量对蛹虫草发酵菌丝体产量的影响
由图4 可知，随着接种量的增加，菌丝体产量呈先上升后下降的趋势。其原因可能是菌株在有限的营养条件下，适宜的接种量可使菌丝体生长旺盛，各营养物质的代谢与转化主要流向菌丝体生长。随后，培养基的营养成分几乎被利用完全，菌丝体达到最大生长限度，开始产生或外溢一些代谢副产物和中间体，其蛋白水解酶的活力逐渐升高，并伴随着菌丝体自溶现象的产生，菌体产量降低。当接种量达到10.0%时，菌丝体产量略有下降。因此，蛹虫草发酵的最佳接种量为7.5%，此时生物量为25.1 g/L。
2.1.6 摇床转速对菌丝体产量的影响
使用摇瓶进行发酵培养时，摇床转速的大小间接影响着发酵液中氧气溶解量的多少。蛹虫草是好氧型微生物，振荡培养可以解决其发酵过程中的缺氧问题，氧气的供应影响着菌体生长的快慢及质量。若转速过快，则通氧量过大，在摇瓶相同的装液量条件下，对蛹虫草菌丝体的剪切力也相对较大，不利于菌体的快速增殖和延伸；若转速过慢，则通氧量不足，剪切力过小，造成菌丝生长迟缓，菌丝体产量低。不同摇床转速对蛹虫草发酵菌丝体产量的影响如图5 所示。
图5 不同摇床转速对蛹虫草发酵菌丝体产量的影响
由图5 可知，当转速为170 r/min 时，蛹虫草菌丝体生长速度最快，生物量达到24.9 g/L。
2.2 响应面试验结果
根据单因素试验结果，选取pH 值、接种量、摇床转速3 个因素，以发酵产物中菌丝体产量为指标，利用中心组合（Box-Benhnken）试验设计原理，进行三因素三水平的响应面试验，其因素与水平见表2，试验结果见表3，方差分析见表4。
表2 响应面试验因素与水平
表3 响应面试验结果
表4 方差分析结果
由表4 可知，此模型P＜0.000 1，具有高度的显著性，其决定系数R2为0.986 4，表明所建立的模型拟合性良好。失拟项P=0.697 9＞0.05，没有显著性，说明试验的误差较小。在选择试验范围内，由F 值大小确定3 个因素对蛹虫草菌丝产量影响程度排序：pH（A）＞转速（C）＞接种量（B）。在二次项中，AC、BC 对蛹虫草菌丝产量有显著的影响，说明AC、BC 之间存在交互作用；AB 对蛹虫草的菌丝产量没有显着影响，表明2种因素之间没有相互作用。响应值的变异系数CV值为0.96%，表明试验操作可信。根据所得数据进行回归分析，拟合得到蛹虫草发酵菌丝产量的预测值对各因素的回归方程为：Y=28.78-1.39A- 0.31B+ 0.48C + 0.05AB - 0.48AC - 0.33BC - 1.31A2-0.66B2- 1.09C2。
经Design-Expert 分析，给出的最优工艺参数如表5 所示。为了验证模型的适用性，结合实际操作的便捷性，将上述条件调整为pH 值6.40，接种量6.50%，摇床转速180.00 r/min，得到菌丝体产量为29.30 g/L，与预测可获得的菌丝体产量29.4 g/L 较为接近，说回归明模型与真实试验值拟合度较高，能够有效的提高蛹虫草菌丝体产量。
表5 Design-Expert 预测最优工艺及验证
3 结 论
采用常见的单糖、双糖、低聚糖分别与蛋白胨和酵母膏组合，筛选出蛹虫草发酵的最适碳氮源分别为蔗糖和蛋白胨。以蛹虫草发酵产物中的菌丝体产量为指标，选取pH 值、接种量、摇床转速3 个因素，通过中心组合（Box-Benhnken）试验原理进行三因素三水平的响应面试验优化发酵条件，得到最佳发酵工艺为pH 值6.39，接种量6.61%，摇床转速178.07 r/min，此时菌丝体产量为29.40 g/L。
