脆皮肠盲样中山梨酸含量的测定

阳文武 黄小兰 周 浓 周祥德*

1（重庆市万州食品药品检验所，重庆 404000）2（重庆三峡学院生物与食品工程学院，重庆 404120）

山梨酸是化学合成的防腐剂，能够抑制食品中微生物的生长和繁殖，从而延长食品的保存时间，保持食品原有的品质和营养价值，是我国目前用量最大的食品防腐剂之一。但山梨酸具有一定的毒性，因此必须对它的使用量和残留量加以控制。国家标准GB 2760—2014 规定，脆皮肠中允许添加一定量的山梨酸，因此对脆皮肠中山梨酸建立快捷、准确的测定方法很有必要。目前常用的方法有薄层法、气相色谱法、液相色谱法。其中液相色谱法高效、快速、灵敏度高，适合大批量样品的检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

Agilent1260 型高效液相色谱仪；KH-2000DB超声清洗机；Sartorius 万分之一电子分析天平（QUINTIX224-1CN）。

山梨酸对照品溶液，购买于北京曼哈格生物科技有限公司，批号：25561YW，170412；甲醇、甲酸，均为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

1.2 试剂溶液配制

亚铁氰化钾溶液（92 g/L）：称取106 g 三水亚铁氰化钾，加入适量水溶解，用水定容至1 000 mL。

乙酸锌溶液（183 g/L）：称取220 g 二水乙酸锌溶于少量水中，加入30 mL 冰乙酸，用水定容至1 000 mL。

乙酸铵溶液（20 mmol/L）：称取1.54 g 乙酸铵，加入适量水溶解，用水定容至1 000 mL，经孔径0.22 μm 水相微孔滤膜过滤后备用。

甲酸- 乙酸铵溶液（2 mmol/L 甲酸+20 mmol/L乙酸铵）：称取1.54 g 乙酸铵，加入适量水溶解，再加入75.2 μL 甲酸，用水定容至1 000 mL，经孔径0.22 μm 水相微孔滤膜过滤后备用。

1.3 标准溶液配制

山梨酸标准中间液：吸取标准溶液（含量为1.0 mg/mL）1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，得质量浓度为100 μg/mL 的标准中间液，贮存于4 ℃冰箱中。

山梨酸标准系列工作液：分别准确吸取不同体积的标准中间液，用水将其稀释成山梨酸含量分别为1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 的标准系列工作液，临用现配。

1.4 供试品溶液的制备

准确称取约2 g（精确到0.001 g）试样于50 mL 具塞离心管中，加水约25 mL，涡旋混匀，于50℃水浴超声（功率300W，频率40kHz）20min，冷却至室温后加亚铁氰化钾溶液2 mL 和乙酸锌溶液2 mL，混匀，于8 000 r/min 离心5 min，将水相转移至50 mL 容量瓶中，于残渣中加水20 mL，涡旋混匀后超声5 min，于8 000 r/min 离心5 min，将水相转移到同一50 mL 容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀。取适量上清液过孔径0.22 μm 滤膜，待液相色谱测定。在此基础上考察了另外4 种前处理方式对山梨酸提取效率的影响。

1.5 仪器条件

色谱柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙酸铵溶液∶甲醇=95 ∶5，流速：1.0 mL/min；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。对流动相进行了优化。

2 结果与分析

2.1 流动相比例对分离效果的影响

在1.5 仪器条件下，山梨酸的保留时间为9.6 min，但样品峰有前沿，如图1 所示。

图1 色谱图（乙酸铵溶液∶甲醇=95∶5）

为使样品目标峰分离良好，在1.5 仪器条件基础上将流动相比例调整为乙酸铵溶液∶甲醇=97∶3，流速降为0.9 mL/min 进行测定，色谱图见图2。由图2 可知，结果目标峰出峰时间延迟至11.5 min，样品峰有前沿。

图2 色谱图（乙酸铵溶液∶甲醇=97∶3）

水相比例已经很大，不太可能通过延迟出峰时间来达到分离目标峰的目的，于是加大有机相比例，调整为乙酸铵溶液∶甲醇=92∶8 进行测定，色谱图见图3。由图3 可知，出峰时间提前至8.7 min，样品峰有比较好的分离。

图3 色谱图（乙酸铵溶液∶甲醇=92∶8）

2.2 前处理方式对山梨酸提取效率的影响

在1.5 仪器条件下，将流动相比例调整为乙酸铵溶液∶甲醇=92∶8，考查5 种前处理方式对山梨酸提取效率的影响，结果见表1。

表1 不同前处理方式对山梨酸测定值的影响

由表1 可以看出，经过4 次提取后，样品中的山梨酸基本被提取出来。另外比较第4 组和第5 组数据，可见沉淀剂对样品中的山梨酸有微弱的吸附作用。

2.3 不同流动相对分离效果的影响

为使测得的数据更加科学、准确，采用流动相甲酸- 乙酸铵溶液（2 mmol/L 甲酸+20 mmol/L 乙酸铵∶甲醇=92∶8 进行验证，结果出峰时间延迟至16.8 min，色谱图见图4。在此仪器条件下，重新测定了上述5 组样品，结果见表2。

由表2 可以看出，5 组样品的山梨酸值均有下降，可以初步推断：当流动相为乙酸铵∶甲醇=92∶8 条件下，样品峰还是有包裹，且与目标峰完全重叠。

图4 色谱图（甲酸- 乙酸铵溶液∶甲醇=92∶8）

表2 不同前处理方式对山梨酸值的影响

3 结 论

本次盲样的真实值为0.140 g/kg，与表2 中2组、3 组的值非常接近，由此可见，在测定脆皮肠中山梨酸时，流动相应选用甲酸- 乙酸铵溶液（2 mmol/L 甲酸+20 mmol/L 乙酸铵）∶甲醇=92∶8，前处理方式应为：每次于残渣中加少量水，提取4次。