饲用枯草芽孢杆菌分离纯化及培养条件优化*

胡 赛，孙 成，刘素梅，贾付康，满 云

(蚌埠学院，安徽 蚌埠 233030)

枯草芽孢杆菌生长迅速，营养需求简单且在生长发育后期形成含水率低、抗逆性强的休眠体芽孢，是制备微生物菌制剂的理想形式。枯草芽孢杆菌在添加到饲料时不仅不消耗饲料的营养，还能保持饲料的质量，提高饲料利用率；进入畜禽肠道可迅速恢复活性发挥益生菌作用；能够产生许多不同活性的酶类和多种氨基酸[1-3]。目前，响应面分析法被广泛应用于食品、轻工、医药卫生等多方面研究领域。本课题通过单因素和响应面优化实验对饲用枯草芽孢杆菌的培养条件进行，提高枯草芽孢杆菌发酵液菌密度及活菌数量[4-7]，为低成本生产饲用枯草芽孢杆菌提供数据支撑[8]。

1 实 验

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器

AB323电子天平，上海海康电子仪器厂；YX-24HDD手提式压力蒸汽灭菌器，江阴滨江医疗设备有限公司；PWT-P42B电热恒温培养箱，合肥华德利科学器材有限公司；SW-CJ-2FD洁净工作台，上海力辰邦西仪器科技有限公司；SW-CJ-2FO紫外可见分光光度计，上海博迅；DHZ-DA全温振荡培养箱，上海五相仪器仪表有限公司；DHG-9023A电热恒温鼓风干燥箱，上海东麓仪器设备有限公司。

1.1.2 主要试剂与材料

葡萄糖，天津市永大化学试剂有限公司；蛋白胨，上海盛思生化科技有限公司；酵母浸膏粉、牛肉浸膏粉，天津市光复精细化工研究所；琼脂粉，上海展云化工有限公司。

供试菌种：蚌埠学院食品与生物工程学院实验室提供。

固体培养基[9-10]：每1 L的蒸馏水加入牛肉浸膏0.5 g、蛋白胨15 g、氯化钠5 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g。

液体培养基：每1 L的蒸馏水加入牛肉浸膏0.5 g、大豆蛋白胨15 g、氯化钠5 g、葡萄糖20 g。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种分离纯化

(1)菌液准备：称取0.1 g固体菌粉溶于100 mL无菌水中，备用。

(2)平板划线：固体培养基，经过121 ℃，20 min高压灭菌锅高压灭菌后冷至不烫手后，在无菌操作台内进行倒平板，将(2)准备好的菌液，用接种环蘸取菌液进行平板划线，放入恒温培养箱(37 ℃)培养24 h。

1.2.2 制备种子液[11]

取平板划线获得的单一菌落接种于高压灭菌121 ℃、20 min后液体培养基中进行摇床培养，摇床培养条件为35 ℃、180 r/min、24 h。取上述菌液1 mL加入9 mL无菌水，重复上述步骤获得三个不同浓度梯度菌液，本实验选择的三个不同的稀释倍数分别为103倍、104倍、105倍。

1.2.3 活菌计数

取不同培养条件下摇床培养的枯草芽孢杆菌菌液，进行梯度稀释，分别取106、107、108三个不同梯度稀释进行平板涂布，将涂布完成的平板用保鲜膜包裹防止染上杂菌，然后放入恒温培养箱中37 ℃培养24 h，通过直接读数法确定菌落数。

1.2.4 OD600值的测定

OD600值测定采用600 nm波长下的吸光度。菌液摇床培养24 h，每隔3 h测一次OD600，根据培养时间和OD600值的对应关系，绘制菌株的生长曲线，便于后续实验数据分析。

1.2.5 单因素试验

(1)装液量对枯草芽孢杆菌生长的影响

通过改变装液量来探究溶氧量对枯草芽孢杆菌菌体生长和芽孢生成的影响。本实验采用250 mL锥形瓶，研究表明摇瓶不同装液量对枯草芽孢杆菌生长有明显的影响，实验采用30 mL、50 mL、70 mL、90 mL四种不同装液量，35 ℃、180 r/min、pH 7、接种量6%进行摇床培养18 h，测定不同装液量对摇床培养活菌数和OD值的影响，筛选出最佳装液量。每个处理设置3次重复。

(2)起始pH值对枯草芽孢杆菌生长的影响[12]

根据OD600值确定枯草芽孢杆菌生长最佳起始pH值采用pH 5、pH 6、pH 7、pH 8四种不同起始pH值，35 ℃、180 r/min、装液量50 mL、接种量6%进行摇床培养18 h，测定不同起始pH值对摇床培养活菌数和OD值的影响，筛选出最佳起始pH值。每个处理设置3次重复。

(3)接种量对枯草芽孢杆菌生长的影响[13]

接种量是影响发酵菌种生长繁殖速度的重要因子，过多或过少都不利于发酵进程的继续。采用2%、4%、6%、8%四种不同接种量，35 ℃、180 r/min、装液量50 mL、起始pH 7进行摇床培养18 h，测定不同接种量对摇床培养活菌数和OD值的影响，筛选出最佳接种量。每个处理设置3次重复。

(4)培养时间对枯草芽孢杆菌生长的影响

采用12 h、16 h、20 h、24 h四种不同培养时间35 ℃、180 r/min、装液量50 mL、起始pH 7、接种量6%进行摇床培养，每隔一定时间测一次OD值同时进行一次稀释平板涂布，测定不同培养时间对摇床培养活菌数和OD值的影响，筛选出最佳培养时间。每个处理设置3次重复。

1.2.6 响应面优化培养条件试验设计[14]

通过前期饲用枯草芽孢杆菌菌株菌体摇床培养条件优化的单因素试验，来筛选出对菌液生长相对明显的因素作为 Plackett-Burman试验的研究因子，采用design-expert-10软件进行试验设计及结果处理。实验设计如表1所示。

表1 响应面设计试验因素水平表

2 结果与讨论

2.1 分离纯化结果

经分离纯化获得的菌株如图1所示，经过多次实验得出稀释平板涂布最佳梯度稀释倍数为106倍。

图1 分离纯化平板图

2.2 装液量对饲用枯草芽孢杆菌OD600值的影响

不同摇瓶装液量对饲用枯草芽孢杆菌OD600值的影响试验结果如图2所示。

图2 不同装液量与OD600值的对应关系

由图2可见，随着装液量的增加，发酵液菌体数量先上升后下降。当250 mL摇瓶的装液量为50 mL时，发酵液菌体OD600值最大，达到1.912。原因是液体含量越小，溶解氧系数越大。但当液体的填充量太小，发酵过程中伴随着水分的蒸发，活菌数量相应减少。因此，选择的装液量为30 mL、50 mL、70 mL装于250 mL锥形瓶中作为响应面设计的三个水平。

2.3 起始pH值对饲用枯草芽孢杆菌OD600值的影响

不同起始pH值对饲用枯草芽孢杆菌OD600值的影响试验结果如图3所示。

图3 不同起始pH值与OD600值的关系

图3可见，不同起始pH值情况下，饲用枯草芽孢杆菌OD600值变化呈现先上升再下降的趋势，当初始pH值为7时，发酵液菌体OD600值达到最大，OD600值为1.912。初始pH值是发酵条件优化的重要环节，适当的pH值可以显著提高发酵产量，pH值偏高或偏低都会导致细胞膜通透性的改变，从而会影响枯草芽孢杆菌对环境中营养物质的吸收利用。不同菌种的最适起始pH值不同，因此，选择的起始pH值为6、7、8作为响应面设计的三个水平。

2.4 接种量对饲用枯草芽孢杆菌OD600值的影响

不同接种量对饲用枯草芽孢杆菌OD600值的影响试验结果如图4所示。

图4 不同接种量与OD600值的对应关系

图4可见，接种量由2%增加到6%时；摇瓶培养18 h，发酵液菌体OD600值逐渐增大，6%时达到1.912；但当接种量为8%时，发酵液菌体数量下降，原因可能是高接种量引起溶解氧的不足，从而影响菌体的生长代谢。接种量过多时，会引起溶解氧的不足，从而会抑制菌体的生长，菌株代谢产物的合成与积累也将受到抑制；接种量过少时，会使菌体的培养时间增长，降低发酵生产效率。因此，选择的接种量为4%、6%、8%接种于250 mL锥形瓶中作为响应面设计的三个水平。

2.5 响应面优化法在培养条件优化中的应用

根据 Plackett-Burman 试验筛选出显著影响因素：装液量(mL/mL，A)、接种量(%，B)、起始pH值(C)，以最陡爬坡试验结果中最大响应值所对应的各因素水平为基准，确定响应面的中心点[15]。实验设计如表2所示。实验分析数据见表2在确定了最佳条件后，在此条件下进行三次平行验证实验，并结合实际条件确定了实际的最佳条件。响应面试验是基于最陡爬升试验所选择的中心点。响应面试验结果见表3。二次模型方差分析结果表明，R-Squared的值为0.963 0>0.9，并且Adj. R2的数值与R2接近，说明拟合分析值准确可靠，采用中心组合设计进行优化是可行的。PRESS小于0.05，说明组合模型具有差异显著性。响应面和等高线图如图6～图11所示，自变量装液量与起始pH值对OD值的交互影响对枯草芽孢杆菌活菌数和OD600的影响是显著的。根据design-expert-10 软件分析得出起始pH值为7、装液量为50 mL/250 mL、接种量为6%，180 r/min摇床培养20 h可获得最大活菌数2.89×109个。

表2 Box-Behnken 设计

表3 Box-Behnken设计回归分析

2.5.1 装液量与接种量对OD600值的交互影响

图5可以看出不同装液量和摇瓶接种量的之间有显著影响。当起始pH值不变时，随着装液量和摇瓶接种量的逐渐增加，枯草芽孢杆菌OD600(Y1)先上升后下降；在装液量为50 mL左右时，摇瓶接种量为6%左右时，此时枯草芽孢杆菌OD600为最高。根据等高线可以分析得出，当装液量不变时，从摇瓶接种量的变化趋势看时，可观察到装液量的等高线比较密集。表明装液量相对于摇瓶接种量对OD600的影响较显著。

图5 装液量与接种量相互影响的曲面图及等高线图

2.5.2 装液量与起始pH值对OD600值的交互影响

图6可以看出不同装液量和起始pH值的之间有显著影响。当起始摇瓶装液量不变时，随着装液量和起始pH值的逐渐增加，枯草芽孢杆菌OD600(Y1)先上升后下降；在装液量为50 mL左右时，起始pH值为7左右时，此时枯草芽孢杆菌OD600为最高。根据等高线可以分析得出，当装液量不变时，从起始pH值的变化趋势看时，可观察到装液量的等高线比较密集。同时起始pH值不变时，从装液量的变化趋势可以看出起始pH值的等高线比较密集，表明装液量和起始pH值对OD600的影响都比较显著。

图6 装液量与起始pH值相互影响的曲面图及等高线图

2.5.3 接种量与起始pH值对OD600值的交互影响

图7可以看出不同摇瓶接种量和起始pH值的之间有显著影响。当起始摇瓶装液量不变时，随着装液量和起始pH值的逐渐增加，枯草芽孢杆菌OD600(Y1)先上升后下降；在接种量为6%左右时，起始pH值为7左右时，此时枯草芽孢杆菌OD600为最高。根据等高线可以分析得出，当起始pH值不变时，从摇瓶接种量的变化趋势可以看出起始pH值的等高线比较密集，表明起始pH值相对于摇瓶装液量对OD600的影响较显著。

图7 接种量与起始pH值相互影响的曲面图及等高线图

2.5.4 装液量与接种量对活菌数交互影响

图8可以看出不同装液量和摇瓶接种量的之间有显著影响。当起始pH值不变时，随着装液量和摇瓶接种量的逐渐增加，枯草芽孢杆菌活菌数(Y2)先上升后下降；在装液量为50 mL左右时，摇瓶接种量为6%左右时，此时枯草芽孢杆菌活菌数为最高。根据等高线可以分析得出，当装液量不变时，从摇瓶接种量的变化趋势看时，可观察到装液量的等高线比较密集。表明装液量相对于摇瓶接种量对活菌数的影响较显著。

图8 装液量与接种量相互影响的曲面图及等高线图

2.5.5 装液量与起始pH值对活菌数交互影响

图9可以看出不同装液量和起始pH值的之间有显著影响。当起始摇瓶装液量不变时，随着装液量和起始pH值的逐渐增加，枯草芽孢杆菌活菌数(Y2)先上升后下降；在装液量为50 mL左右时，起始pH值为7左右时，此时枯草芽孢杆菌活菌数为最高。根据等高线可以分析得出，当装液量不变时，从起始pH值的变化趋势看时，可观察到装液量的等高线比较密集。同时起始pH值不变时，从装液量的变化趋势可以看出起始pH值的等高线比较密集，表明装液量和起始pH值对活菌数的影响都比较显著。

图9 装液量与起始pH值相互影响的曲面图及等高线图

2.5.6 接种量与起始pH值对活菌数交互影响

图10可以看出不同摇瓶接种量和起始pH值的之间有显著影响。当起始摇瓶装液量不变时，随着装液量和起始pH值的逐渐增加，枯草芽孢杆菌活菌数(Y2)先上升后下降；在接种量为6%左右时，起始pH值为7左右时，此时枯草芽孢杆菌活菌数为最高。根据等高线可以分析得出，当起始pH值不变时，从摇瓶接种量的变化趋势可以看出起始pH值的等高线比较密集，表明起始pH值相对于摇瓶装液量对活菌数的影响较显著。

图10 接种量与起始pH值相互影响的曲面图及等高线图

3 结 论

本研究采用单因素优化确定几种不同影响因素最佳值，然后采用Box-Benhnken 设计的方法，并且利用design-expert-10 软件进行设计分析，是分析优化饲用枯草芽孢杆菌培养条件的有效途径[17]。结合摇瓶装液量、接种量和初始pH值三个主要因素，利用响应面法建立了芽孢杆菌液体发酵产孢的拟合数学模型，方程如下：

以OD值为响应值的二次方程：

以活菌数为响应值的二次方程：

优化后得到摇床培养最佳条件为：接种量6%、装液量50 mL/250 mL、起始pH值为7、温度35 ℃、转速180 r/min。此条件下获得活菌数和OD600值为最高，活菌数达2.89×109；OD600值达1.936。本实验研究的饲用枯草芽孢杆菌摇床培养条件优化，对后续菌种保藏上架都有一定的参考价值。因此，发酵工艺参数的优化和改进的研究还有待于进一步开展。