纤维堆囊菌产埃博霉素B的发酵条件优化

龚国利，王 娜， 刘丽丽， 游银伟

(1.陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021； 2.山东省农业科学院 高新技术研究中心， 山东 济南 250100)

0 引言

粘细菌是一类普遍存在于土壤、堆肥及腐败的树皮中的原核生物[1]，属于革兰氏阴性细菌，具有复杂的多细胞行为[2].粘细菌是生物活性物质的生产者，能够产生广泛的具有活性的次级代谢产物，同时也是天然药物的优良资源之一.纤维堆囊菌是粘细菌中唯一能降解纤维素的种群[3]，从中发现了许多作用机制独特、结构新颖的生物活性物质，引起了学者研究的兴趣.

埃博霉素(epothilone)是一类粘细菌纤维堆囊菌产生的天然大环内酯类物质[4,5]，是一种新型的抗肿瘤药物.它的作用机制与紫杉醇相同，通过促微管聚合作用抑制肿瘤细胞的增殖[6,7]，但它在水溶性、安全性以及抗肿瘤活性等方面优于紫杉醇[8].埃博霉素化学结构简单，易于进行修饰，引起了生物、医学、制药及有机合成等学科领域的高度重视.埃博霉素A和埃博霉素B是纤维堆囊菌产生的两种主要产物[9]，因其在埃博霉素的类似物中活性较高而被广泛研究，其中埃博霉素B活性更高，大量体外实验的评价显示了埃博霉素B是紫杉醇最具希望的替代者[10].2007年，施贵宝公司开发的埃博霉素B衍生物Lxabepilone获得FDA批准在美国上市，在治疗乳腺癌方面具有明显的效果[11].

目前，埃博霉素产量低，不稳定，受培养条件和环境等因素的影响很大，这些因素为其开发和应用带来了很大的困难，所以在发酵生产过程中，主要通过菌种选育和优化发酵工艺条件来提高埃博霉素产量.微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要赋予合适的环境条件才能够使它的生产能力充分表现出来，这两个环节是相辅相成的.

为了提高埃博霉素B的产量，降低生产成本，本实验在前期优化培养基的基础上，通过单因素试验和正交试验设计对发酵条件进行优化，为其规模化生产奠定了基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

纤维堆囊菌SoF5-76(Sorangium cellulosum SoF5-76)本实验室保存菌.来源：由本实验室从土壤中筛选，经过基因组重组技术选育获得，埃博霉素B产量为14.3 mg/L[12].

1.1.2 培养基

(1)CNST培养基： KNO30.05%， Na2HPO40.025%，MgSO4·7H2O 0.1%， FeCl30.001%， 微量元素液1 mL/L， 琼脂2 %， pH 7.2.

(2)M26培养基：马铃薯淀粉0.8%，大豆蛋白胨0.2%，葡萄糖 0.2%， 酵母粉0.2%， MgSO40.1%，CaCl20.1%， EDTA-Fe3+1 mL/L， pH 7.2.

(3)发酵培养基：马铃薯淀粉3.9 g/L，脱脂奶粉2.2 g/L，无水氯化钙1.3 g/L，葡萄糖1 g/L，豆饼粉1.5 g/L，七水硫酸镁2.5 g/L，EDTA-Fe3+3 mL/L，微量元素(TE )0.5 mL/L，pH 7.2，树脂XAD-16 2% .1×105Pa高压蒸汽灭菌20 min.

1.1.3 主要试剂与仪器

(1)主要试剂：Epothilone B标准品购于Singma公司；XAD-16树脂购于美国Sigma公司.

(2)仪器： Waters-2487-2420-1525高效液相色谱仪，美国Waters公司.

1.2 试验方法

1.2.1 培养方法

(1)种子培养：将保藏在固体斜面培养基中的菌种接入放有已灭菌滤纸片的CNST平板上，倒置于恒温培养箱中在30 ℃条件下培养5～7 d后，转接于 M26培养基中，装液量为50/250 mL三角瓶，在30 ℃、170 r/min的条件下摇床培养72 h后，得到作为发酵培养的种子液.

(2)发酵培养：以5%(V/V)接种量将所得种子液接种到发酵培养基中进行摇床培养，发酵体系为300 mL三角瓶装液量为50 mL，在30 ℃、170 r/min的条件下摇床培养5 d.

1.2.2 埃博霉素B提取及含量测定

(1)埃博霉素B提取：发酵结束后，收集树脂，用10倍体积甲醇振荡浸提24 h后，弃去树脂，甲醇浸提液放入真空干燥箱中烘干，再加入500μL甲醇复溶，转移到离心管中.

(2)埃博霉素B检测：采用HPLC定量分析，液相色谱条件为：色谱柱,YWG，C18，10μm，250×4.6 mm；Waters-2487高效液相色谱仪；UV紫外检测器；检测波长,249 nm;流动相,甲醇∶水=65∶35(体积比)；上样体积,20μL;时间,30 min;流速,1 mL/min.埃博霉素B的定量采用本实验室用的标准曲线，方程如下：

Y=0.132X+0.003 5

采用HPLC检测埃博霉素B所得的峰面积，根据标准曲线换算成埃博霉素B产量.

1.2.3 发酵条件优化

(1)单因素试验设计.采用单因素试验，分别考察发酵培养基的初始pH、装液量、转速、接种量、种龄、温度和发酵时间对埃博霉素B产量的影响.

(2)正交试验设计.在单因素试验的基础上，选取部分对埃博霉素B产量影响较大的因素(初始pH、装液量、接种量、温度)进一步进行发酵条件的优化，每个因素设定三个水平，采用四因素三水平正交设计L9(34)进行试验.正交试验因子与水平设计见表1.

表1 正交试验因子与水平设计

2 结果与讨论

2.1 不同单因素对埃博霉素B发酵产量的影响

2.1.1 培养基初始pH对埃博霉素B产量的影响

pH是影响微生物正常生理活动的一个重要指标[13]，纤维堆囊菌培养的pH范围是中性的，为了确定菌株发酵产埃博霉素B的最佳pH，选择了初始pH为5.0、5.8、6.6、7.4、8.2的发酵培养基进行试验，其他培养条件保持不变，即种龄为72 h，接种量5%(V/V)，装液量为50 mL /250 mL，在30 ℃、170 r/min的条件下摇床培养5 d.试验结果如图1所示.分析可知，在发酵培养基初始pH为7.4时，埃博霉素B产量达到最大值为28.02 mg/L.

图1 培养基初始pH对埃博 霉素B产量的影响

2.1.2 装液量对埃博霉素B产量的影响

在微生物发酵过程中，控制溶氧，满足生产菌对养分的需求，是提高发酵水平的关键因素之一[14].摇瓶发酵时，培养基的装液量与摇床转速基本可以反映溶氧水平.在初始pH 7.4、转速170 r/min、种龄为72 h、接种量5%(V/V)、温度30 ℃、发酵时间为5 d的条件下，本次试验通过改变250 mL摇瓶装液量，研究不同装液量对埃博霉素B发酵产量的影响.实验结果见图2.结果显示，装液量对埃博霉素B产量影响显著，装液量为20 mL时，虽然溶解氧量充足，但由于养分不足，菌体生长缓慢，导致埃博霉素B产量较低.随着装液量增加，养分充足，埃博霉素B产量开始增加，装液量增加到50 mL时，产量达到最大为28.53 mg/L.继续增加装液量，由于溶解氧不足，菌体生长受限制，发酵产量开始下降.故选取50 mL为最适装液量.

图2 装液量对埃博霉素B产量的影响

2.1.3 摇床转速对埃博霉素B产量的影响

摇床转速同样影响发酵液中氧气的溶解量.在初始pH为7.4、装液量为50/250 mL、种龄为72 h、接种量5%(V/V)、温度30 ℃、发酵时间为5 d的条件下，改变转速(140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min)，进行发酵培养.发酵结束后进行埃博霉素B检测，结果如图3所示.经分析可知，当摇床转速较低时，发酵液中溶解氧量不足，不利于菌体生长，导致埃博霉素B发酵产量较低，当转速达到200 r/min时，产量达到最大值为29.81 mg/L.随着转速继续升高，发酵产量开始下降，可能是由于转速过高，使部分菌受到破坏，从而使发酵产量下降.所以选取200 r/min为摇床转速的最优值.

图3 摇床转速对埃博霉素B产量的影响

2.1.4 种龄对埃博霉素B产量的影响

在发酵过程中，种龄能够影响种子的质量及接入发酵培养基的效果，生命力旺盛的种子有利于菌体生长，老化的种子不利于菌体的生长繁殖，会影响菌株发酵产量.在初始pH为7.4、装液量为50/250 mL、转速为200 r/min、接种量为5%(V/V)、温度为30 ℃、发酵时间为5 d的条件下，本试验选取不同种龄的种子进行摇瓶发酵实验，结果见图4.经分析可知，种龄在36～60 h变化时，埃博霉素B产量随之增加，在60 h时，达到最大值为30.16 mg/L.种龄继续增大，埃博霉素B产量先缓慢下降，然后迅速降低.故最适种龄为60 h.

图4 种龄对埃博霉素B产量的影响

2.1.5 接种量对埃博霉素B产量的影响

在抗生素发酵过程中，采用较大的接种量可以缩短菌体增殖时间，提高抗生素产量.但是接种量过大会使菌体生长过快，造成营养基质缺乏或溶氧不足，影响抗生素的合成.为了提高埃博霉素B产量，必须选择合适的接种量.在初始pH为7.4、装液量为50/250 mL、转速为200 r/min、种龄为60 h、温度为30 ℃、发酵时间为5 d的条件下，研究不同接种量对埃博霉素B产量的影响.由图5可知，当接种量为2%时，由于菌体数量限制使得埃博霉素B产量较低，随着接种量增大，产量缓慢增加，当接种量为8%时，产量达到最大值为30.63 mg/L.接种量继续增大，产量却随之降低.因此本试验选取8%为最适接种量.

图5 接种量对埃博霉素B产量的影响

2.1.6 温度对埃博霉素B产量的影响

在初始pH为7.4、装液量为50/250 mL、转速为200 r/min、种龄为60 h、接种量为8%(V/V)、发酵时间为5 d的条件下，研究不同温度对埃博霉素B产量的影响.由图6可知，低温不利于纤维堆囊菌发酵产埃博霉素B，随着温度升高，菌体代谢加快，埃博霉素B产量大幅度提高，当温度达到30 ℃时，发酵产量最高为30.15 mg/L.随着温度继续升高，产量却大幅度降低，故最适温度为30 ℃.

图6 温度对埃博霉素B产量的影响

2.1.7 发酵时间对埃博霉素B产量的影响

埃博霉素B为纤维堆囊菌的次级代谢产物，稳定期开始大量积累，同时接种量也对发酵时间有一定的影响.本次试验在初始pH为7.4、装液量为50/250 mL、转速为200 r/min、种龄为60 h、接种量为8%(V/V)、温度为30 ℃的条件下，进行摇瓶发酵，分别培养3、4、5、6、7 d后进行埃博霉素B检测，试验结果如图7.结果分析可知，发酵时间为6 d时，埃博霉素B产量达到最高31.28 mg/L.继续增加培养时间，产量基本保持不变，故最适发酵时间为6 d.

图7 发酵时间对埃博霉素B产量的影响

2.2 正交试验设计

根据上述单因素试验结果，初始pH、装液量、接种量、温度对纤维堆囊菌发酵产埃博霉素B的影响较大，将这4个因素进一步通过四因素三水平L9(34)正交试验进行优化，得到最优组合.正交试验结果以及直观分析结果见表2.

表2 正交试验结果与分析

由表2可知，RA>RD>RB>RC，即选取的4个因素对埃博霉素B产量影响的主次关系为：初始pH>温度>装液量>接种量，表明发酵培养基的初始pH对埃博霉素B发酵产量影响最为显著，最不显著的影响因子为接种量.此外从表中还可以看出发酵条件的最优组合为：A2B2C3D2，即初始pH为7.4，装液量为50 mL/250 mL，接种量为10%，温度为30 ℃.由于正交试验表中没有符合此发酵条件的方案，所以按照上述得到的最优发酵条件做验证试验.

2.3 验证试验

在上述所得到的最优发酵条件下进行摇瓶发酵，同时将优化前的发酵条件即在初始pH为7.2、种龄为72 h、接种量5%(V/V)、装液量为50 mL/300 mL、温度30 ℃、转速170 r/min、发酵时间5 d的条件下作为对照.试验结果见表3.由表3可知，最优发酵条件下埃博霉素B的产量为35.24 mg/L，与优化前(29.95 mg/L)相比产量提高了17.67%.

表3 验证试验

3 结论

纤维堆囊菌易受菌体本身以及环境条件的影响，进而影响菌体的生物合成能力.为了提高埃博霉素B的产量，以降低生产成本，本试验在前期优化发酵培养基的基础上，进一步对发酵条件进行优化.首先采用单因素试验考察初始pH、装液量、转速、种龄、接种量、温度、发酵周期7个因素对埃博霉素B产量的影响，得到各因子的最优水平.在单因素试验的基础上，将对埃博霉素B影响较大的因素(初始pH、装液量、接种量、温度)进一步进行正交试验，得到最优组合.最终确定最优发酵条件为:初始pH7.4、装液量50 mL、转速200 r/min、种龄60 h、接种量10%、温度30 ℃、发酵周期6 d.在此最优条件下进行摇瓶发酵，埃博霉素B产量达到35.24 mg/L，比优化前(29.95 mg/L)提高了17.67%.

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