TFF1基因启动子双荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

李俊龙 刘小康 王祎△

(1.第三军医大第一附属医院西南医院研究中心，重庆 404100；2.四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610041)

三叶因子1(Trefoil factor 1，TFF1)是三叶因子家族蛋白之一，又称为雌激素诱导蛋白，首先在雌激素受体表达阳性的人乳腺癌细胞MCF-7中发现，是典型的雌激素应答基因[1]。TFF1在胃肠道粘膜屏障和修复中发挥重要作用，包括细胞的迁移、分化、血管生成等[2, 3]。在胃癌细胞中，TFF1通过上调细胞周期依赖性激酶的水平，延迟细胞的周期进程，抑制细胞凋亡[4, 5]。并且也有研究表明在胃癌的发生发展过程中，TFF1通过下调miR504的水平激活p53基因的表达，从而发挥抗肿瘤作用[6]。总之，目前对于TFF1在不同肿瘤中发挥的作用及其作用机制存在争议的。而另一方面，近年来有学者胆囊癌患者的原发性肿瘤组织中发现了雌激素受体ER以及孕激素受体PR的大量表达，并且通过免疫组化检测到了TFF1的阳性表达，提示TFF1在胆囊癌的发生发展过程中具有重要作用[7]。因此本研究构建了含有人TFF1基因野生型启动子质粒和突变型质粒的荧光素酶报告基因载体，并研究了雌激素对TFF1启动子转录活性的影响，为寻找TFF1基因的核心启动子序列，进一步研究TFF1基因的转录调控机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与细胞

胆囊癌细胞GBC-SD细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库、大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α购自日本Takara公司；定向诱变试剂盒购自美国Stratagene公司；载体质粒pGL3-Basic质粒以及内参质粒pRL-SV40质粒和双荧光素酶检测试剂盒均购自美国Promega公司；转染脂质体Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；质粒提取试剂盒购自美国Omega公司。

1.2 方法

1.2.1构建人野生型及突变型TFF1基因启动子荧光素酶报告基因载体

根据NCBI数据库中人TFF1基因序列(登录号：AB038162.1)，选取TFF1基因CDS区前-568位至-2位核苷酸作为启动子序列，其中包含经典的雌激素应答元件(Estrogen response elements，ERE)序列和非经典雌激素受体结合部位——激活蛋白1(Activating protein-1，AP-1)结合位点序列。并在5′端加入KpnI酶切位点，在3′端加入Hind III酶切位点，基因合成序列如下：GGTACC(KnpI)GATTACAGGCGTGAGCCACTGCGCCAGGCCTACAATTTCATTATTAAAACAATTCCACTGTAAAAGAATTAGCTTAGGCCTAGACGGAATGGGCTTCATGAGCTCCTTCCCTTCCCCCTGCAAGGTCACGGTAGGCC(ERE)ACCCCGTGAGCCACTGTTGTCACGGCCAAGCCTTTTTCCGGCCATCTCTCACTATGAATCA(AP-1)CTTCTGCAGTGAGTACAGTATTTACCCTGGCGGGAGGGCCTCTCAGATATGAGTAGGACCTGGATTAAGGTCAGGTTGGAGGAGACTCCCATGGGAAAGAGGGACTTTCTGAATCTCAGATCCCTCAGCCAAGATGACCTCACCACATGTCGTCTCTGTCTATCAGCAAATCCTTCCATGTAGCTTGACCATGTCTAGGAAACACCTTTGATAAAAATCAGTGGAGATTATTGTCTCAGAGGATCCCCGGGCCTCCTTAGGCAAATGTTATCTAACGCTCTTTAAGCAAACAGAGCCTGCCCTATAAAATCCGGGGCTCGGGCGGCCTCTCATCCCTGACTCGGGGTCGCCTTTGGAGCAGAGAGGAGGCAAGCTT(HindⅢ)。另外使用DNASTART软件，分别设计ERE位点突变和AP-1位点突变的TFF1基因序列，启动子基因序列由苏州金唯智公司合成。将目的片段克隆至pGL3-Basic载体上，于16℃连接过夜，次日将产物转化E.coli DH5α感受态细胞，接种于含Amp的LB固体培养皿，37℃倒置培养过夜。分别挑取单克隆，接种于LB液体培养基，提取质粒进行酶切鉴定，并送苏州金唯智公司进行测序鉴定。

1.2.2启动子荧光素酶活性鉴定

胆囊癌细胞GBC-SD细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中。将2×105个细胞接种于24孔板中，于37℃、5% CO2培养箱中培养过夜。细胞处理分为空白对照组(转染pGL3-Basic质粒)，实验组(转染野生型或突变型重组质粒)。当细胞达到70-80%融合度时，参照Lipo2000转染试剂说明，每孔中的比例为DNA：Lipo=0.5 μg：2 μL，将构建基因与相应的内参基因pRL-SV40按照9：1的比例共转染细胞。24 h后裂解细胞，按照双荧光素酶检测试剂盒说明测定各组的相对荧光素酶活性。

1.2.3统计学处理

2 结果

2.1 TFF1启动子荧光素酶报告基因载体双酶切鉴定结果

提取构建好的pGL3-TFF1质粒，pGL3-TFF1-△ERE突变质粒，pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒，并采用Kpn I和HindIII进行双酶切鉴定，酶切产物电泳可得到约1.2kb小片段和4.1kb包含目的片段的大片段，与插入的TFF1启动子目的片段和线性pGL3-Basic大小结果相符合，见图1。

图1 双酶切鉴定启动子荧光素酶报告基因注：1: undigested; 2: digested with Kpn I、HindIII; 3: DNA Marker；A：pGL3-TFF1， B：pGL3-TFF1-△ERE， C：pGL3-TFF1-△AP-1， D：pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1质粒双酶切定。

2.2 野生型及突变型TFF1基因启动子质粒测序鉴定结果

pGL3-TFF1质粒，pGL3-TFF1-△ERE突变质粒，pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒DNA测序由苏州金唯智公司完成，测序结果与本实验中设计序列相比较，结果完全一致，证明质粒构建成功，示意图见图2。

2.3 野生型及突变型TFF1基因启动子转录活性

将构建的4种启动子质粒分别与内参质粒pRL-SV40共转染人胆囊癌细胞GBC-SD细胞后，检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶报告基因活性，并将两者的比值作为该启动子的相对活性。结果如图3A所示，与pGL3-Basic组相比较，pGL3-TFF1的基础转录活性升高了约2.20倍，pGL3-TFF1-△ERE突变质粒的转录活性升高约了1.5倍，pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒的转录活性升高了0.076倍，pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒的转录活性升高了0.056倍。表明AP-1结合位点的基因序列对TFF1基因启动子的转录活性具有关键作用。

图2 野生型及突变型TFF1基因启动子的荧光素酶报告载体示意图

为了进一步检验雌激素与TFF1蛋白表达的关系，我们将各启动子质粒分别转染进人胆囊癌细胞GBC-SD细胞后，给与10-9mol·L-1外源性雌激素刺激24 h，后测定各组荧光强度。实验结果如图3B所示，与无雌激素处理组比较，雌激素能显著升高野生型pGL3-TFF1质粒和突变型pGL3-TFF1-△ERE质粒的转录活性(P<0.001。但对pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒和pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒的转录活性影响不大。

图3 双荧光素酶报告基因检测启动子转录活性注：A：启动子突变对TFF1转录活性的影响。双荧光素酶报告基因检测系统检测构建的启动子质粒的基础转录活性，与空白对照组比较，***P<0.001。B:雌激素对胆囊癌TFF1表达的影响。E2代表该组经雌激素处理，pGL3-basic-luc为空载质粒。雌激素刺激组与无雌激素刺激组相比较，TFF1转录活性显著升高，***P<0.001；与雌激素刺激的野生型TFF1启动子组相比较，AP-1位点突变以及双位点突变组TFF1转录活性极显著性降低，###P<0.001。

3 讨论

三叶因子家族是一类小分子调节肽，包括3个成员TFF1、TFF2、TFF3。其中TFF1又称为雌激素诱发蛋白，是经典的雌激素应答基因。正常情况下主要在胃体和胃窦粘膜上皮表达[8]。目前研究认为TFF1的异常表达是多种疾病发生发展的重要病理学基础，如TFF1表达缺失引起胃肠粘膜慢性损伤[9]。在正常的胆囊组织中无TFF1的表达，但在胆囊炎、不典型增生以及胆囊癌出现时大量表达。Kornprat在研究中也证实了这一点，其研究指出TFF1在正常粘膜中不表达，上皮细胞出现炎症改变时开始表达，并且在35%的原位癌以及24%的转移癌患者癌组织中检测到TFF1的免疫反应性，且随着肿瘤分期与分级的增加，TFF1的免疫反应性是显著降低的，这说明TFF1可能是胆囊结石、胆囊炎和胆囊癌之间某种缺失的联系[10]。但目前胆囊癌中TFF1蛋白表达的调控机制仍未有报道，雌激素以及雌激素受体在胆囊癌发生发展过程中的作用机制也未阐明。

本实验成功构建了野生型和突变型TFF1基因启动子双荧光素酶报告质粒，并通过瞬时转染将其成功转染进了胆囊癌细胞GBC-SD。根据上述的实验结果，我们得知ERE位点和AP-1位点同样参与到了胆囊癌中TFF1的调控，但ERE作为雌激素的应答元件，其在胆囊癌中发挥的作用是有限的，TFF1的表达调控更多依赖的是AP-1结合位点。胆囊组织作为一个非性激素靶器官，其ER的表达存在一定限制，这可能是限制ERE位点发挥调控作用的一个原因。本研究为将来深入了解胆囊癌发病机理，及其发生发展过程提供一定的理论依据。