辛伐他汀协同单轴静态牵张力促进成骨细胞成骨基因表达*

杨孝勤 李正强 陈军 方炜 马伟群 万荻 郑俊发

(南方医科大学口腔医院，广东 广州 510280)

被称为“内源性骨组织工程”的牵张成骨避免了自体骨组织移植需开辟第二术区和人工材料植入的免疫排斥反应及强度不够等缺点，同时实现周围软组织的同步扩展等优势，目前已经成为一种治疗正颌外科、颌骨重建、口腔种植治疗颌骨畸形和颌骨缺损的重要方法[1]。然而，牵张成骨作为一种新技术，在许多方面还需深入研究，主要有牵张成骨仍存在固定期过长、新骨形成不良等弊端，如何缩短治疗时间，减少并发症，提高再生骨质量成为当前牵张成骨需要解决的最大难题。目前众多学者采取了多种辅助方法[2,3]，尽管部分方法获得了一定的效果，然而均未能获得广泛的临床运用，存在各种各样的问题，如：技术复杂、费用高、周期长、生物学不安全等缺点。因此，寻找一种简单、廉价、安全的方法来促进骨组织再生仍是目前牵张成骨研究领域关注的一个热点。

辛伐他汀则是临床上最常用的他汀类药物，羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，有很好的降高血脂、高胆固醇作用，已在临床上应用20多年，具有高度的生物安全性。近年来研究发现辛伐他汀能通过诱导骨形态发生蛋白(Bone morphogeneticprotein，BMP)促进成骨，已被应用于修复骨折和骨缺损取得了较好的效果。因此，本研究拟利用本课题组建立的多单元细胞拉伸装置评估辛伐他汀能否协同单轴静态牵张力促进成骨细胞的成骨基因表达，为后期动物实验提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料、仪器

多单元细胞拉伸装置由四川大学与电子科技大学联合研制，新生SD大鼠由四川大学华西实验动物中心提供，性别不限，细胞培养相关试剂与材料购自美国Gibco公司，实时定量RT-PCR试剂购于Takara公司，Ⅰ型鼠尾胶原蛋白、辛伐他汀购于美国Sigma公司。

1.2 多单元细胞拉伸装置

多单元细胞拉伸装置是本课题组与电子科技大学联合研制。多单元细胞拉伸装置，由控制单元、显示单元、按键单元、驱动单元、动力加载单元、细胞培养单元、向控制单元和驱动单元提供工作电流的电源组成，见图1。根据本课题组以前研究提示10%单轴静态牵张力促进成骨细胞的成骨基因表达最强[4]。因此，本研究选择用10%单轴静态牵张力。

图1 多单元细胞拉伸装置

1.3 成骨细胞的体外培养与鉴定

本实验采用两步酶消化法原代培养成骨细胞[5]。简言之，将新生1-2 d SD大鼠的颅盖骨剪碎成约0.5 mm2大小的骨碎片。加入质量浓度0.25%胰蛋白酶1 mL，在细胞培养箱内预消化后弃除消化上清液，再加入1 mg·mL-1Ⅱ型胶原酶溶液1 mL，细胞培养箱内消化30 min，收集消化上清液1000×g离心5 min，将收集到的细胞混匀后，按细胞数2×105个细胞/瓶接种于25 mL培养瓶中进行培养，待细胞覆盖程度达到培养瓶底面积的80%时，按1∶3的比例进行传代培养，将3-6代细胞用于后续实验。通过细胞形态观察、碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫组织化学法、四环素和茜素红染色矿化结节法鉴定培养细胞为成骨细胞。

1.4 实验分组与方法

将第3-6代的2 mL含2×104个·mL-1成骨细胞悬液接种至细胞培养单元内包被了Ⅰ型鼠尾胶原蛋白的硅胶膜上的硅胶膜矩形环内。37oC，5% CO2培养箱培养24 h后细胞已完全贴壁于硅胶膜上，取出硅胶膜矩形环，补加10 mL含10% FBS的DMEM培养基。24 h后对成骨细胞施加10%的单轴静态牵张力或培养在含10-7mol·L-1辛伐他汀的培养液中。实验分为4组，分别为Stretch组、Sim组、Stretch+辛伐他汀组和Ctrl组。其中Stretch组为10%单轴静态牵张力，Sim组为10-7mol·L-1辛伐他汀，Stretch+Sim组为10%单轴静态牵张力合并10-7mol·L-1辛伐他汀，Ctrl组为未处理的对照组。加力3 d后收集细胞，每组实验重复3次。

1.5 实时定量PCR检测runx 2、alp基因表达

按照HiFi-MMLV cDNA 第1链合成试剂盒和UltraSYBR Mixture说明书进行操作。runx2(NM_053470.2)上游引物：5’-cttcgtcagcgtcctatcagttc-3’，下游引物：5’-cagcgtcaacaccatcattctg-3’；alp(NM_013059.1)上游引物：5’-gaccctgccttaccaactcatt-3’，下游引物：5’-gtggagacgcccataccatct-3’；GAPDH(XR_009170.1)上游引物：5’-tatgactctacccacggcaagt-3’，下游引物：5’-atactcagcaccagcatcacc-3’。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按以下条件扩增：95℃预变性8 min；95℃变性15 s、60℃退火、延伸1 min，35个循环。溶解曲线分析为95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s，60℃、15 s。采用2-△△Ct法分析目的基因相对表达量。实验重复3次。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 新生SD大鼠颅骨成骨细胞的体外培养与鉴定结果

如图2a所示，新生SD大鼠颅骨原代培养的成骨细胞多呈梭形、三角形或星形的不规则形态，细胞形态饱满，边界清晰，表面较光滑。成骨细胞传代培养后逐渐伸展变形，胞体逐渐展开成短梭形，继而变成星形或多极形(图2b)。图2c示alp染色实验，成骨细胞染色后核呈紫色，胞浆出现中等量的红棕色颗粒，有些为咖啡色或棕褐色颗粒。图2d显示了Ⅰ型胶原表达的免疫组织化学染色，可见细胞呈Ⅰ型胶原强阳性。图2e示成骨细胞钙化结节四环素染色，荧光显微镜观察可见钙化结节呈明亮的黄色荧光。图2f显示钙化结节茜素红染色，成骨细胞是非接触抑制性生长，4-5周时细胞汇合呈复层生长，局部堆积形成灶状白色钙化结节，用茜素红染色鲜红者表明为钙化组织。

图2 新生SD大鼠颅骨成骨细胞的体外培养与鉴定结果注：a，原代成骨细胞倒置相差显微镜下观×10；b，传代成骨细胞倒置相差显微镜下观×100；c，成骨细胞碱性磷酸酶染色普通显微镜下观×100；d，成骨细胞Ⅰ型胶原表达的免疫组织化学染色普通显微镜下观×100；e，成骨细胞钙化结节四环素染色荧光显微镜下观×40；f，成骨细胞钙化结节茜素红染色普通显微镜下观×40。

2.2 辛伐他汀增强单轴静态牵张力诱导的成骨细胞的runx 2、alp mRNA的表达

通过实时荧光定量RT-PCR检测成骨细胞runx2、alpmRNA的表达，结果如图3a，b所示，相对对照组，10%单轴静态牵张力、10-7mol·L-1辛伐他汀能分别诱导成骨细胞runx2、alpmRNA的表达增加(P<0.05)。进一步结果发现10-7mol·L-1辛伐他汀与10%单轴静态牵张力共同作用下成骨细胞runx2、alpmRNA的表达要比单独10-7mol·L-1辛伐他汀或10%单轴静态牵张力显著提高(P<0.05)，见图3a，b。

图3 成骨细胞runx2、alp mRNA的表达水平注：*P<0.05。

3 讨论

牵张成骨是通过切开骨皮质后一周逐渐牵拉骨痂以延长骨的方法，是利用骨组织细胞在受到张应力刺激时活化、增殖，原位再生一段新骨的生物原理发展起来的一种新的骨发育不足与缺损修复方法，在口腔颌面整复外科领域有着广泛的应用前景[1]。然而，牵张成骨作为一种新技术，在许多方面还需深入研究，主要有牵张成骨骨再生过程涉及的细胞和信号分子网络复杂，其在细胞和分子水平上的生物学机制尚未阐明。其次，牵张成骨仍存在固定期过长、新骨形成不良等弊端，限制了该技术在临床上的应用和推广。因此，探索牵张成骨骨再生的细胞和分子机制，寻求有效措施促进牵张成骨骨再生，缩短治疗周期，减少骨形成不良等并发症，是国内外学者探索的一个重要前沿课题。本研究利用已建立的多单元细胞拉伸装置对成骨细胞施加10%单轴静态牵张力，结果发现10%单轴静态牵张力促进了成骨细胞的成骨相关基因runx2和alpmRNA表达。这与Yang等[6]研究结果一致，他们通过Flexcell加力系统对成骨样细胞施加最大幅度为10%的周期性间断性张应力，表明周期性间断性张应力增强了人牙周膜细胞的runx2、alpmRNA的表达。由于在牵张成骨过程中细胞所受的牵张力应是单轴静态持续的，因此本课题使用单轴静态牵张力可能更能模拟成骨细胞在牵张成骨过程中所受的力学刺激。

Mundy等通过动物实验对3万多种天然化合物进行筛选发现他汀类药物(尤其是辛伐他汀和洛伐他汀)是唯一具有促进骨形成代谢作用的天然药物，可以增强BMP-2启动子活性，促进碱性磷酸酶活性升高和矿化结节形成，促进骨形成[7]。他汀类药物由小而稳定的分子组成，不易被蛋白水解，易于合成，而且价格便宜。研究证明，辛伐他汀具有良好的促成骨作用，不但可以改善全身的骨代谢状态，而且可以增强局部骨修复效能，同时可以抑制破骨细胞的骨吸收相关途径，进一步促进成骨作用[8]。本研究结果发现10-7mol·L-1辛伐他汀能增加成骨细胞的成骨相关基因runx2和alpmRNA表达。

目前众多学者采取了多种辅助方法如物理方法(电刺激、电磁刺激、机械刺激、高压氧、低强度脉冲超声刺激等)、生长因子和激素(骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、生长激素、降血钙素等)、细胞移植(自体骨髓间充质干细胞、成骨细胞等)、组织工程法(自体骨髓间充质干细胞复合血小板丰富的血浆和人凝血酶凝胶)、药物(二膦酸盐、硫酸钙等)[3,9,10]。尽管部分方法获得了一定的效果，然而均未能获得广泛的临床运用，存在各种各样的问题，如：技术复杂、费用高、周期长、生物学不安全等缺点。因此，寻找一种简单、廉价、安全的方法来促进骨组织再生仍是目前牵张成骨研究领域关注的一个热点。辛伐他汀具有良好的促成骨作用，同时具有生物安全性高、易于合成和价格便宜的优点。本课题组对培养在含10-7mol·L-1辛伐他汀的培养液的成骨细胞施加将10%单轴静态牵张力，结果表明辛伐他汀能协同10%单轴静态细胞牵张力上调成骨细胞的成骨基因runx2、alpmRNA的表达，为后续的辛伐他汀促进颌骨牵张成骨的动物实验提供基础。