运动对睡眠剥夺引起胰岛素抵抗和T2DM风险升高的缓解作用初探

齐一凡 王昊然 万莉红

(1. 四川大学华西基础医学与法医学院基础医学2015级基地班；2. 华西临床医学院2016级；3. 华西基础医学与法医学院药理学教研室，四川 成都 610041)

睡眠缺乏是现代社会中常见的问题，与一系列慢性健康问题相关，特别是2型糖尿病胰岛素抵抗(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)。研究表明，连续6天每日4小时睡眠，甚至一天睡眠时间不足4小时都会导致胰岛素敏感性降低[1,2]。流行病学研究的证据也支持睡眠不足会诱发葡萄糖耐受异常和胰岛素抵抗[3]。生物钟节律失调和骨骼肌线粒体功能受损可能是睡眠导致胰岛素抵抗的原因[4]。运动影响时钟基因表达，可能会降低睡眠不足带来的负面影[5]。本实验拟构建睡眠剥夺-胰岛素抵抗小鼠模型，探究运动对于睡眠不足引起胰岛素抵抗的缓解作用，为睡眠不足引发的T2DM提供新的干预思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物

32只3周龄SPF级C57BL/6小鼠，雌雄各半，体重10±2 g，批号：SCXK(渝)2018-0003，购自重庆恩斯维尔科技有限公司。所有小鼠分笼饲养，每笼8只。饲养条件：室内温度23±1℃，相对湿度50%±5%，自由饮食水，光暗周期为12/12 h(6∶00am开灯，6∶00pm关灯)。实验开始前适应性饲养3 w。

1.1.2仪器与试剂

实验室自制改良多平台睡眠剥夺装置：标准实验塑料笼(长37.5 cm×宽32.0 cm×高16.0 cm)，内固定14根供小鼠站立的小木块(长2.0 cm×宽2.0 cm×高5.0 cm)；小鼠血糖测量仪(北京怡成生物电子技术股份有限公司)；小鼠胰岛素试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：E-EL-M2614c)；葡萄糖溶液；啮齿类动物固定器。

1.2 方法

1.2.1实验分组

32只小鼠适应环境饲养至6周龄，体重15 g～25 g，采用随机数字表法随机分为：对照组、睡眠剥夺组、运动A组、运动B组，每组8只，雌雄各半。除对照组外，其余各组小鼠建立睡眠剥夺模型；运动A，B组小鼠在此基础上采用不同运动模式进行干预，具体如下：运动A组小鼠进行不间歇的长时间游泳训练30 min；运动B组小鼠进行间歇游泳训练，每游泳10 min休息10 min，重复3个循环，总游泳时长为30 min。

1.2.2睡眠剥夺-胰岛素抵抗模型

利用小鼠不能站立入睡的生理特征，采用改良多平台睡眠剥夺法(Modified multiple platform，MMPM)对小鼠进行睡眠剥夺[6]。根据预实验结果，本次实验采取睡眠剥夺16 h·d-1，连续4 d的方案，使小鼠在高存活率下表现出胰岛素抵抗。

具体方法：向改良多平台睡眠剥夺装置中注入水，水深为4 cm。实验当天6:00 am将小鼠放入平台睡眠剥夺装置，每个装置8只小鼠，小鼠在装置中活动不受限制，自由饮食和饮水。16 h后(即10:00 pm)将小鼠从剥夺装置中取出，用吸水纸轻柔擦干小鼠全身，吹风机吹干后放入鼠笼，给予充足的食物和水，恢复8 h后进入第二天睡眠剥夺阶段，持续4 d。

1.2.3运动训练

采用水深8 cm睡眠剥夺水箱，使小鼠在25 ℃深水中强迫游泳，强迫游泳实验一般可被分为4个状态，即游泳、攀爬、漂浮、下沉状态。为达到实验目的，采用轻柔刺激法使小鼠保持在游泳状态。

1.2.4口服葡萄糖耐量试验(Oral glucose tolerance test，OGTT试验)

所有小鼠禁食不禁水12 h后立即自尾静脉取血测量0 min血糖。并灌胃给予小鼠20%葡萄糖溶液2 g·kg-1，在给予葡萄糖后30 min、60 min、90 min、120 min分别测量各时刻血糖值，记录数据，绘制OGTT曲线。

1.2.5胰岛素测定

准备质量分数为15%乙二胺四乙酸钠盐(EDTA)溶液，按照每毫升血液1.2 mg EDTA，提前加入样品管中。小鼠禁食不禁水12 h后立即自尾静脉取血40 μL，1000×g离心15 min，取上清。采用酶联免疫吸附法检测小鼠血浆胰岛素浓度，按照小鼠胰岛素试剂盒步骤进行操作。

1.2.6HOMA-IR评估

实验开始前需要根据所有小鼠空腹时血糖和胰岛素值计算HOMA公式中的校正系数，根据实验前的稳态平均水平计算本次实验公式为：HOMA-IR=禁食血糖(mmol·L-1)×禁食胰岛素(mU·L-1)/0.58。实验后将每组小鼠OGTT试验0 min时血样数据带入公式计算，经统计学分析判断胰岛素抵抗是否产生组间差异。

1.2.7统计学分析

2 结果

2.1 OGTT试验结果

OGTT试验糖耐曲线趋势：运动A组与对照组曲线下降趋势相似，运动B组有下降趋势但血糖值高于对照组，睡眠剥夺组短暂下降后进入平台期；OGTT试验30 min时血糖：睡眠剥夺组和运动B组小鼠空腹血糖明显高于对照组(P<0.05)，运动A组与对照组无显著差异(P>0.05)；OGTT试验60 min时血糖：睡眠剥夺组和运动B组的血糖明显高于对照组(P<0.05)，运动A组与对照组无显著差异(P=0.43)；OGTT试验90 min时血糖：睡眠剥夺组和运动B组的血糖明显高于对照组(P<0.05)，运动A组与对照组无显著差异(P>0.05)；睡眠剥夺组和B运动组出现糖耐量异常，见图1。

图1 OGTT糖耐曲线量曲线注：与对照组相比，*P<0.05；与睡眠剥夺组相比，#P<0.05。

2.2 HOMA-IR模型评估结果

通过将禁食12h后每只小鼠血液样本中血糖值和胰岛素含量带入公式计算，可得每只小鼠的胰岛素抵抗指数(IR)，通过统计学分析发现：睡眠剥夺组的胰岛素抵抗组明显高于对照组(P<0.05)；在睡眠剥夺基础上进行不间歇长时间游泳训练的运动A组小鼠，胰岛素抵抗水平明显低于睡眠剥夺组(P<0.05)，与对照组相比没有明显区别(P>0.05)；在睡眠剥夺基础上进行间歇游泳训练的运动B组小鼠，胰岛素抵抗水平与睡眠剥夺组相比没有统计学差异(P>0.05)，见图2。

图2 HOMA-IR评估胰岛素抵抗注：与睡眠剥夺组相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

本次实验旨在验证运动能够缓解小鼠睡眠缺乏导致的胰岛素抵抗，实验要求小鼠睡眠剥夺模型与小鼠运动模型相结合。由于睡眠缺乏和运动为本实验的两个控制变量，为了避免小鼠睡眠剥夺过程中产生大量运动，干扰运动模型，本实验采用改良多平台睡眠剥夺法[6]替代常用的旋转圆筒睡眠剥夺法，达到控制变量的目的。

HOMA-IR模型是1985年由Matthews等人提出的一种稳态模型，通过测量禁食后的血糖和胰岛素含量评估胰岛素抵抗程度。在评估胰岛素敏感性的方法中，正常血糖高胰岛素钳夹技术是测量胰岛素抵抗的金标准，但是该技术需要多次取血，因此应用于小鼠实验不仅对小鼠本身产生较大负担而且对实验人员要求较高，并不适用。而采用HOMA-IR模型评估胰岛素敏感性，试验过程中仅需取空腹血液1次，能充分保证小鼠存活，且重复性高，与正常血糖高胰岛素钳夹技术相比有很高的相关性[7,8]，故本实验采取HOMA-IR模型评估小鼠胰岛素水平。人群计算公式为：HOMA-IR=禁食血糖(mmol·L-1)×禁食胰岛素(mU·L-1)/22.5，系数22.5为正常理想人群条件下的校正因子。由于HOMA模型开发基于正常人群的稳态，不能简单套用于实验动物，应根据此次所用实验动物实验前的稳态计算公式中的校正系数。

睡眠缺乏是2型糖尿病胰岛素抵抗发展的重要风险因素，而运动可能会减轻睡眠缺乏的影响。本次实验证明了长时间不间断运动可以作为睡眠不足引起的胰岛素抵抗和二型糖尿病的早期干预手段，对于改善胰岛素抵抗的效果比同样时间长度的间断运动更好。本次实验中设计两种运动，A，B运动的总时间相同，但是B运动相较于A运动存在间隔。对于相同时间的连续运动和间隔运动之间的区别已有研究进行探索。12周的每天30min运动训练与3次10min间隔运动训练相比，在最大摄氧量和血胆固醇构成上没有明显区别[9]。另一项对于小鼠的研究表明，30min的连续运动训练和10min的3次间隔训练在改变线粒体代谢的信号通路上没有发现明显的不同，通过对于线粒体代谢p38 MAPK通路的研究表明两种运动都可以提高线粒体代谢信号转导[10]。运动缓解睡眠缺乏导致胰岛素抵抗可能是通过改善生物节律和线粒体信号转导实现的，对于连续运动和间隔运动影响睡眠缺乏后的生物节律和线粒体转导还没有相关研究，其具体机制以及不同运动模式间存在的区别将在后续实验中进行探索。