拮抗金黄色葡萄球菌的益生菌菌株的筛选及初步研究

郑佳奇，刘欣宇，佟文英，张天华，崔吉焘，朱灿，孙冶，李新鸣*

（1.沈阳医学院基础医学院临床医学专业2014级，辽宁 沈阳 110034；2.基础医学院临床医学专业2016级；3.基础医学院病原生物学教研室）

益生菌产生抗微生物的物质以清除病原菌，阻断毒素调控的反应，干扰病原性细菌营养的获取和粘附，并限制病原菌的存在及致病作用［1］。益生菌可以通过增强细胞免疫和体液免疫来调节系统免疫应答。益生菌的研究多集中在肠道益生菌上，研究最多的是乳酸杆菌属和双歧杆菌属［2］。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），属于葡萄球菌属，是人类化脓性细菌感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染［3］。金黄色葡萄球菌是引起医院感染的常见病原菌。由于细菌的进化和抗生素的滥用，该菌的耐药性逐渐增强，特别是甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）。近年来，MRSA感染的耐药率和多重耐药菌株不断增长，导致临床抗感染治疗难度增加［4］。

目前国内外关于益生菌用于金黄色葡萄球菌感染及耐药菌株仅仅处于尝试阶段。Howard等［5］首次在实验外科伤口中用植物乳酸杆菌活菌来预防金黄色葡萄球菌的感染。国内有少量报道乳酸杆菌用于抑制金黄色葡萄球菌生长［6-7］。这也说明了通过微生物干预金黄色葡萄球菌感染有着光明的前景，但正式应用临床还有待更多的实验。因此，有必要开展益生菌对金黄色葡萄球菌，特别是对耐药性金黄色葡萄球菌的拮抗作用研究，可以为临床有效治疗金黄色葡萄球菌感染提供新思路，为微生态制剂疗法提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基及试剂 金黄色葡萄球菌（CICC 10201）、铜绿假单胞菌（CICC 10003）、大肠埃希菌（CICC 20152）、植物乳酸杆菌（CICC 21790）（对照菌）购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。MRS培养基、脑心浸液肉汤培养基（BHI）、营养琼脂培养基购于青岛海博生物技术有限公司。TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit购于宝生物工程（大连）有限公司。A549肺癌细胞由病原生物学教研室保存。MTT试剂盒、细胞培养液等试剂购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2 益生菌菌株分离培养 吸取100 μl酸奶原液，用BHI培养基稀释，制备原液、10倍、50倍、100倍稀释液。取200 μl稀释液分别涂布在营养琼脂平板和MRS平板上，置于37℃温箱中培养24 h。选择合适稀释倍数的菌液平板，分别选取不同形态特征菌落计数。挑取单个菌落分别分段划线接种于MRS平板，37℃温箱中培养24 h。对获得的不同分离株的纯培养物置于含30%甘油的BHI培养基中，-20℃冻存保存。

1.3 初步筛选对金黄色葡萄球菌有抑制作用的益生菌菌株 采用牛津杯法［8］，对分离培养获得的39株分离株进行致病菌拮抗试验。金黄色葡萄球菌接种于BHI培养基，放入摇床37℃过夜培养后，用新鲜BHI培养基调节菌液浓度为108～109个/ml种子液备用。益生菌分离株分别挑取1～2个单菌落放入5 ml BHI培养基中37℃摇床培养18 h，制成种子液。取金黄色葡萄球菌种子液1∶30倍稀释，稀释混匀后吸取150 μl加入到营养琼脂平板上，用涂布棒均匀涂布。将灭菌的牛津杯放置在涂布后的营养平板上，向牛津杯内加入培养的乳酸杆菌种子液200 μl；取等体积BHI培养基作为阴性对照。平板于37℃、营养琼脂培养基pH 7.2～7.4、避光培养24 h，测量产生的抑菌环直径大小。对有拮抗性的2株分离株（A和B株），按照试剂盒操作说明，提取细菌基因组DNA，PCR扩增16S rDNA片段，由生工生物工程上海（股份）有限公司序列分析，对菌株进行鉴定是否为乳酸杆菌属。

1.4 摇瓶培养条件优化 实验摇瓶培养基本条件：温度35℃，培养时间36 h，接种量25%，培养基初始pH 5.5。根据前期实验初步测定，培养摇瓶装液量为50 ml培养液/250 ml培养瓶、转速180 r/min，菌量达到最高，所以确定其为培养条件优化试验的摇瓶装液量、摇床转速。培养条件优化试验选择的因素为拮抗菌株培养温度、初始pH、接种量、培养时间。

取抑菌效果强的1株乳酸杆菌（B株）接种于MRS培养基，同前面方法制成种子液。将高压灭菌的BHI液体培养基分装到多个三角瓶内，用盐酸和氢氧化钠多次少量加入分装好的BHI液体培养基调节培养基pH值。分别将温度（℃）设置为32、35和37℃，初始pH设置为4、5.5和7，接种量设置为10%、25%和50%，培养时间设置为24、36和48 h，进行3水平4因素正交实验。一共9组实验，分别按照表1中相应的条件接种种子液。

表1 拮抗菌株培养条件因素水平表

1.5 乳酸杆菌对金黄色葡萄球菌的拮抗作用 利用正交实验选出的最佳培养条件，培养乳酸杆菌B株，以培养原液作为种子液。同时按前面拮抗实验方法，制备金黄色葡萄球菌稀释菌液，并加入到营养平板涂布均匀后，将灭菌后的牛津杯放置营养平板上，分别向牛津杯内加入培养的乳酸杆菌种子液200 μl，检测益生菌菌株对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用。对照采用BHI培养基、乳酸杆菌A及植物乳酸杆菌，对照菌株种子液制备方法同拮抗初筛实验。

1.6 细胞毒性试验 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养A549肺癌细胞，收集对数期细胞并用培养液调整细胞浓度后分别加入到96孔板，使每孔终体积为 180 μl，5 000个细胞/孔。培养板置于37℃，5%CO2温箱培养至细胞贴壁后，再继续培养16 h，至细胞单层铺满96板孔底，更换为不含血清的培养液。乳酸杆菌B株按照优化培养条件制备菌原液，用无血清细胞培养液按照 104、105、106、107、108、109倍比稀释原液，分别取100 μl不同浓度梯度的益生菌菌液加入单个培养孔，设5个重复孔。培养板置于37℃，5%CO2温箱培养16 h。吸取上清液，每孔加入90 μl新鲜培养液，再加入 10 μl MTT 溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS液冲洗2～3遍后，再加入含MTT的培养液。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入100 μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在490 nm处测量各孔的吸光度值（OD）。实验中设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、BHI培养基、细胞培养液、MTT、二甲基亚砜）。

2 结果

2.1 初步筛选出对金黄色葡萄球菌有抑制作用的益生菌菌株 牛津杯法对39株分离株进行拮抗实验，结果显示2株分离株有抑制金黄色葡萄球菌生长的作用，其中1株菌株拮抗作用较强。经16S rDNA序列分析均为乳酸杆菌属。这2株分离益生菌菌株命名为乳酸杆菌A株、乳酸杆菌B株。见表2。

表2 金黄色葡萄球菌拮抗初筛实验结果

2.2 培养条件的优化 按照设计的正交实验，对乳酸杆菌B株进行培养优化，根据益生菌活菌计数的结果筛取得到最适培养条件为接种量为10%，pH值为5.5，温度为32℃，培养时间36 h。见表3。

表3 拮抗菌株培养条件正交实验结果

2.3 乳酸杆菌对金黄色葡萄球菌的拮抗实验 利用正交实验选出的最佳培养条件培养乳酸杆菌B株，测定培养细菌原液对金黄色葡萄球菌的抑制作用。拮抗实验结果显示优化培养后的乳酸杆菌B株仍具备较好的抑菌活性，见图1。

图1 金黄色葡萄球菌拮抗实验结果

2.4 MTT细胞毒性试验 不同稀释倍数的乳酸杆菌B优化培养原液与A549细胞共同孵育培养后，进行MTT检测。结果发现，经One way ANOVA分析与对照组比较，不同浓度条件下乳酸杆菌益生菌株对A549细胞增殖无明显影响（P＞0.05），见图2。

图2 乳酸杆菌B株MTT试验结果

3 讨论

目前耐药性金黄色葡萄球菌在临床中发现病例较多，如甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌对红霉素类和β-内酰胺类抗菌药物有较强的耐药性［9-10］。耐药性金黄色葡萄球菌致病力更强，而且耐药机制还未完全明确，为临床抗生素治疗带来了巨大的困难。因此，如何有效治疗金黄色葡萄球菌特别是耐药菌株引起的感染，是临床亟待解决的问题。有报道益生菌联合应用敏感性抗生素可抑制金黄色葡萄球菌生长［11］。使用合适的益生菌可以减轻炎症，维持肠道内微生物平衡，因而抑制病原菌增殖，提高机体免疫力［12］。早期使用乳酸杆菌用于呼吸道机械通气患者可以有效降低肺炎发生率［13］。

本实验获得乳酸杆菌分离株2株，可抑制金黄色葡萄球菌生长。而且实验中使用的金黄色葡萄球菌菌株是氯霉素、万古霉素耐药菌株。乳酸杆菌菌株B经优化培养后可在实验室水平获得较高活菌量，同时保持较强的抑菌能力。而且优化培养的菌株经MTT试验检测其对A549细胞增殖的影响，结果显示不同稀释梯度的益生菌和对照组比较差异均无统计学意义，提示从酸奶中分离的乳酸菌菌B株对细胞生长抑制作用。由于其对于细胞无毒性，且来源于乳酸制品，该乳酸杆菌分离株为后续开展益生菌干预金黄色葡萄球菌感染提供了基础。使用肠道益生菌预防、治疗金黄色葡萄球菌感染是新尝试，可为解决临床耐药性问题提供新途径。

本研究通过乳酸杆菌分离株对金黄色葡萄球菌的抑制作用，为乳酸杆菌预防、治疗金黄色葡萄球菌所致疾病提供了实验依据。目前治疗金黄色葡萄球菌所致的细菌性腹泻，益生菌联合应用抗生素具有良好的治疗效果［14］。由于乳酸杆菌属于人体正常菌群成员，并且乳酸杆菌容易大量培养制备。因此，尝试使用对乳酸杆菌干预耐药性金黄色葡萄球菌，具有良好的应用前景。