一种呼吸道口咽菌群系统分类和快速鉴定的方法

李新鸣，孙冶，孙跃岭，王哲，张松，崔楠，肖纯凌*

（1.沈阳医学院，辽宁 沈阳 110034；2.辽宁省环境污染与微生态重点实验室；3.中国人民解放军北部战区总医院和平院区检验科）

尽管相对于肠道微生态，对于呼吸道微生态研究较少，但呼吸道菌群仍然是决定呼吸道健康与否的决定性因素［1-2］。由于大气污染日益严重，呼吸道感染发病率有增高趋势，尤其是对儿童和老年人致死率高，而成为全球关注的问题［3-6］。以往认为呼吸道感染仅仅是由致病菌造成的，随着科学技术手段的进步，现在认为呼吸道菌群与呼吸道健康状况密切相关［7］。当前我国城市大气污染形势严峻，大气污染对呼吸道菌群产生影响，菌群构成发生改变。如何有效、迅速地评定受检者呼吸道菌群的状态至关重要。本研究建立了一种呼吸道口咽菌群系统分类和快速鉴定的方法，这种方法可以简便、迅速地分析口咽菌群构成，为有效评定口咽菌群的健康状态提供直接依据。

1 材料与方法

1.1 呼吸道菌群的采集和菌悬液制备 取108例志愿者（男54例，女54例，年龄18～22周岁）口咽咽拭标本：用一次性无菌长棉签（扬州洋生医药科技有限公司）刮取志愿者咽部后，立即放入装有1 ml的脑心浸液（北京索莱宝科技有限公司）+5%胎牛血清（北京索莱宝科技有限公司）的细菌培养管中，涡旋剧烈震荡30 s后，将获得的菌悬液室温静置30 min。

1.2 不同浓度的菌悬液制备 将菌悬液分别稀释至1、10、100及500倍。步骤：将静置好的菌悬液（1倍）再次涡旋剧烈震荡30 s，移液器吸取100 μl菌悬液加入到900 μl的脑心浸液+5%胎牛血清中，涡旋剧烈震荡30 s，此时菌悬液浓度稀释至10倍；移液器吸取100 μl稀释10倍的菌悬液加入到900 μl的脑心浸液+5%胎牛血清中，涡旋剧烈震荡30 s，此时菌悬液浓度稀释至100倍；移液器吸取100 μl稀释100倍的菌悬液加入到400 μl的脑心浸液+5%胎牛血清中，涡旋剧烈震荡30 s，此时菌悬液浓度稀释至500倍，冰上静置备用。

1.3 呼吸道菌群的分离培养 分别用移液器吸取 100 μl稀释 1倍、10倍、100倍、500倍的菌悬液，加入到血固体培养基（含有5%无菌脱脂羊血（北京索莱宝科技有限公司）营养琼脂）和巧克力固体培养基（北京陆桥技术有限责任公司），用无菌不锈钢涂布棒（上海生工生物工程有限公司）均匀涂布，直至有生涩感。分别用移液器吸取100 μl稀释1倍、10倍、100倍的菌悬液，加入到厌氧固体培养基（北京陆桥技术有限责任公司），用无菌不锈钢涂布棒均匀涂布。分别用移液器吸取100 μl稀释1倍、10倍的菌悬液，加入到麦康凯固体培养基（广东环凯微生物科技有限公司）、沙保弱固体培养基（广东环凯微生物科技有限公司），用无菌不锈钢涂布棒均匀涂布。将血固体培养基、麦康凯固体培养基及沙保弱固体培养基置于37℃温箱培养，将巧克力固体培养基置于37℃、5%CO2温箱培养，将厌氧固体培养基置于厌氧培养盒中，37℃温箱培养。

1.4 呼吸道菌群的系统分类和计数 当培养时间为24 h时，取出血固体培养基、巧克力固体培养基及麦康凯固体培养基，分别对1倍和10倍稀释菌悬液培养物菌落特征进行观察及计数，计数中大型菌落数量和描述菌落形态特征及判定溶血性；对100倍稀释培养物，计数小菌落、针尖状菌落数量并描述菌落形态特征；对500倍稀释培养物，通过可见光源照射到固体培养基上，计数针尖状菌落数量和描述菌落形态特征及溶血性。当培养时间为48 h时，取出厌氧固体培养基，对1倍和10倍稀释菌悬液培养物，分别计数中大型菌落数量和描述菌落形态特征；对100倍稀释培养物，计数小菌落、针尖状菌落数量和描述菌落形态特征。当培养时间为120 h时，取出沙保弱固体培养基，分别对1倍、10倍稀释培养物，计数真菌的数量和描述菌落的形态特征［8-9］。

1.5 菌株的16S rDNA扩增和鉴定 挑取单菌落溶解于 20 μl的 0.1%Triton-100的 EP管中，100℃沸水煮5 min。按照PCR反应试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司，R176，25 μl的反应体系）说明书，扩增细菌16S rDNA片段。反应成分 ：Pre mix 12.5 μl）、Forward Primer 0.25 μl、Reverse Primer 0.25 μl、ddH2O 8 μl、模板DNA 4 μl。PCR反应程序为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1.5 min，共30个循环，最终扩增片段约1.1 kb。PCR产物测序由上海生工生物公司完成。

2 结果

2.1 呼吸道菌群在不同培养基上菌落特征的分类 呼吸道口咽菌群在不同的选择性培养基培养，每种选择性培养出的菌落种类及菌落形态特征见表1。

2.2 呼吸道菌群16S rDNA序列扩增结果 按照表1所示菌落特征，挑取血固体培养基、巧克力固体培养基、麦康凯固体培养基及厌氧固体培养基生长的不同类型菌落，通过快速菌落PCR扩增出16S rDNA特异性片段，经上海生工生物公司完成测序。菌落PCR扩增结果见图1。

图1 呼吸道菌群16S rDNA片段扩增结果

2.3 呼吸道菌群16S rDNA测序与菌株鉴定 将16S rDNA测序结果，与NCBI基因序列库比对，从众多的细菌序列比对结果中选出相似性（Similarity）＞95%的结果即可认为是同一种菌，获得菌株在种级别上的鉴定结果。部分结果见表2。

表1 呼吸道菌群在不同培养基上菌落特征的分类

表2 呼吸道菌群部分测序结果

3 讨论

人体口咽与外界相通，是空气、食物通过的共同部位，也是病原菌侵入下呼吸道和肺部并引起感染的必经部位。口咽部定植的微生物构成种类、数量是相对恒定的［7，10-11］。Xiao 等［12-13］提出了呼吸道微生态变化是大气污染亚临床损害的早期效应，而口咽固有定植菌中的甲型链球菌群改变，可以作为呼吸系统早期损害效应的指示菌。

传统的细菌分类方法，通常将混合菌液分布在平板上，根据细菌菌落的形态、镜下细菌的形态及革兰染色等来判断细菌基本的生物学特性，然后，根据这些特点，设计一些生理生化试验、糖发酵试验及毒性试验最终鉴定出菌株。传统方法工作量大，能源消耗大，鉴定出来的结果往往到细菌的属，而进一步鉴定到种或者是亚种很难。本研究依据108例健康人群口咽菌群分离培养结果，对4种细菌培养基和1种真菌培养基上生长的27种特征菌落进行了分类。首次对可常规分离培养获得的口咽菌群菌落特征进行了详尽准确的归纳，对于后续口咽菌群中细菌菌株的鉴定及系统分类提供了基础。在传统分离培养方法基础上，有效地结合新兴的16S rDNA分子生物学技术，利用菌落PCR特异性扩增特征菌落的16S rDNA片段并测序分析鉴定细菌，建立了细菌菌株快速、准确的鉴定方法。目前，传统的细菌分离鉴定方法，仍然是最通用的方法，其主要依靠细菌分离培养、染色及大量生化反应鉴定，整个程序耗时长，对于细菌在种这一级的鉴定缺乏准确性［14-15］。本研究所建立的鉴定方法克服了传统细菌鉴定方法的不足，能在3～5 d内对特异性的细菌的属、种及株作出明确鉴定。因此，可以快速、准确地显示口咽菌群中重要定植菌群的构成。

我国大气污染状况面临长期持续存在，大气污染直接呼吸系统产生影响，开展呼吸系统菌群研究至关重要［16-17］。建立简便、有效的呼吸道菌群分离及鉴定方法，及时准确地反映呼吸道健康状态是关键。本研究所建立的口咽菌群系统分类和快速鉴定的方法，有助于开展呼吸道菌群的实时检测，指示呼吸道状况。