周氏克金岩方对Lewis肺癌小鼠凝血功能的影响

陈美娟，蒋日磊，胡 澄，程子昱，路悦阳，李祺瑞，顾 玲，李红晓，张 旭

(南京中医药大学医学与生命科学学院，江苏 南京 210023)

肿瘤转移是临床上导致癌症病人死亡的主要原因。肿瘤转移的关键调节信号来源于癌细胞和肿瘤微环境细胞分子之间的相互作用，包括肿瘤相关的成纤维细胞、免疫细胞及内皮细胞等。其中，肿瘤细胞与血小板的相互作用既存在于肿瘤微环境，也存在于血液环境或腹水中，对肿瘤的生长和转移至关重要[1]。临床超过30%的恶性实体瘤病人中都存在血小板增多症[2]。血小板数量和聚集程度的明显提高不仅促进肺癌的血行转移[3]，还是造成肺癌病人静脉栓塞的重要原因[4-5]。“周氏克金岩方”(简称克方)为国医大师周仲瑛教授的临床肺癌治疗验方。前期研究表明，其具有较好的抑瘤作用，同时对小鼠生存期及生存质量具有明显的改善作用[6]。本研究拟揭示该方对Lewis肺癌小鼠模型凝血功能的影响。

1 材料与方法

Tab 1 Effects of Ke formula on plasma coagulation parameters in Lewis lung cancer bearing mice

1.1 材料

1.1.1实验动物及细胞株 清洁级C57BL/6小鼠36只，♂，体质量(18～22) g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，许可证号：SCXK(苏)2017-0001。饲养于南京中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK(苏)2014-0001。小鼠Lewis肺癌细胞(Lewis lung cancer cell line, LLC)，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2药物 周氏克金岩方(冬瓜子15 g、胆南星12 g、鱼腥草15 g、金荞麦15 g、山慈菇10 g、金银花15 g、红花10 g、苏木10 g、半夏10 g、猫爪草15 g、南沙参12 g、麦冬12 g、玉竹12 g)，由南京中医药大学方剂学实验室按常规方法煎制成浸膏，稀释至所需浓度[7]。

1.1.3试剂 胎牛血清、RMPI 1640培养液，Gibco公司；凝血指标检测试剂盒，均购自Sekisui Medical Co., LTD。

1.1.4仪器 CP3000全自动凝血分析仪(日本积水医疗科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 LLC细胞株使用含10%胎牛血清的RPMI 1640(青霉素100 kU·L-1、链霉素100 kU·L-1，pH 7.2)培养液，在5% CO2、37 ℃培养箱中培养。

1.2.2动物模型的建立 取6～8周的健康C57BL/6小鼠，25 ℃恒温条件饲养。将体外培养至对数生长期的肺癌LLC细胞按1×1010·L-1的浓度，取0.2 mL注射入小鼠右上肢皮下，待瘤生长到3～5 mm，则造模成功，具体方法同文献[6]。

1.2.3分组及给药方法 造模成功小鼠进行随机分组，分为正常组(Normal)、模型组(Model)、阿司匹林(19.5 mg·kg-1)组、周氏克金岩方低、中、高剂量(Ke 0.95、1.9、3.8 mg·kg-1)组，每组6只，灌胃给药15 d。

1.2.4凝血指标检测 将标本上全自动血凝仪检测，采血后4 h内完成检测。

1.2.5统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，组间两两比较用完全随机设计的独立样本t检验。

2 结果

2.1 周氏克金岩方对Lewis肺癌小鼠抗凝血相关指标的影响如Tab 1所示，相对于造模组，阿司匹林组明显延长了活化部分凝血酶原时间(APTT)值(P<0.05)，同时给药高剂量组也明显延长了APTT时间(P<0.05)；相对于造模组，阿司匹林组明显延长了造模后凝血酶时间(TT)水平(P<0.05)，给药高剂量组同样明显延长了TT水平(P<0.05)。

2.2 周氏克金岩方对Lewis肺癌小鼠促凝血相关指标的影响如Tab 1所示，造模组明显升高了纤维蛋白原(FIB)的水平(P<0.05)，而给药中剂量组则明显降低了FIB的水平(P<0.05)。

3 讨论

本研究结果显示，在接种Lewis肺癌移植瘤后，小鼠的抗凝血指标中凝血酶原时间(PT)及TT的值相对于正常组均有所降低，表现出高凝特征，阿司匹林给药明显延长了APTT及TT水平。同样，在高剂量的周氏克金岩方给药后，也明显延长了APTT及TT的水平，显示出该复方抗凝血的药效作用。而对于促凝血指标，造模组FIB的水平相对于模型组明显升高，而周氏克金岩方中剂量给药组则明显降低FIB的值。结果表明，周氏克金岩方中、高剂量给药对于肺癌模型的高凝血特征有明显的改善作用。