蛋白激酶D1对心肌梗死大鼠心肌组织炎症和凋亡的影响

杨 雷，刘 萍，刘 暖，王 倩，毛秉豫

(南阳理工学院河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室，河南 南阳 473004)

2017年，心血管病研究报告指出，2015年中国城市、农村心血管病死亡占比分别高达42.61%和45.01%，心肌梗死是引发死亡的主要原因之一[1]。心梗后梗死区域周边和非梗死区心肌组织容易发生细胞凋亡，进而改变心肌的血流动力学参数，造成心脏收缩和舒张功能障碍，引发心室重塑[2]。因此，预防和控制心肌细胞凋亡是减缓心室重塑的有效对策之一[2]。

心梗心肌组织缺血损伤后，炎症反应调控蛋白如Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)、黏胶蛋白/肌腱蛋白C(Tenascin-C，TN-C)、核转录因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)p50、NF-κB p65，炎症介质如白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)、IL-6等，以及凋亡调控蛋白Bcl-2、caspase-3、Bax激活，启动炎症和凋亡反应，进而引发心室的不良重构[3]。蛋白激酶D1(protein kinase D1，PKD1)在心血管系统中，参与血管新生、心肌收缩、心肌重塑等进程[4-6]，但其对心肌梗死后心肌细胞凋亡和炎症反应的调控作用尚不清楚。本研究旨从分子生化角度，分析PKD1给药对大鼠心肌梗死后炎症和凋亡的影响。

1 材料

1.1 实验动物45只Wistar大鼠，♂，SPF级，8周龄，体质量(200±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0011。实验在南阳理工实验动物伦理委员会(批准号：NYIST-20180128)指导下进行。

1.2 药物与试剂PKD1，购自美国Pierce公司；caspase-3、Bax、Bcl-2一抗，购自美国Sigma公司；TLR4、TN-C、NF-κB p50、NF-κB p65一抗及RNA提取试剂盒，均购自Santa Cruz上海公司；TUNEL染色试剂盒，购自北京百奥莱博公司；RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒，购自大连宝生物公司；IL-1、IL-6、NF-κB p50和NF-κB p65的TaqMan探针，由Annoron北京公司代理设计。

1.3 仪器CUT6062型病理切片机(德国SLEE公司)； NanoDrop-ND2000型紫外超微分光光度计(美国Thermo Fisher公司)；T10高速组织匀浆机(德国IKA公司)；Nikon Tis型荧光显微镜及配套分析软件NIS-Elements Software BR(日本尼康公司)。

2 方法

2.1 动物造模和分组将大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(Model)组和PKD1组，每组15只。模型组和PKD1组参照之前文献的方法[5]，通过永久性结扎左前降支冠状动脉制作心肌梗死模型；Sham组仅手术而不结扎血管。术后，PKD1组给予1 mg·kg-1·d-1的PKD1，Sham和模型组给予等量生理盐水，均灌胃7 d。在7 d结束时，30 mg·kg-1戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，进行血流动力学评估。评估结束，颈总动脉放血法处死动物，进行相关实验分析。

2.2 血流动力学评估将SPR-838压力容积导管经左颈动脉插入麻醉后大鼠的左心室(left ventricle, LV)腔内，接入压力换能器，应用BL-420F生物机能实验系统，记录LV舒张末期容积(end-diastolic volume，EDV)、收缩末期容积(end-systolic volume，ESV)、等容舒张常数(isovolumic relaxation constant，Tau)、最大压力导数(maximum derivative of pressure，Max dp/dt)、最小压力导数(minimum derivative of pressure，Min dp/dt)等数据。

2.3 HE染色取处死后大鼠的心脏，分离左心室和室间隔前2/3，参照之前文献的方法[5]，4%多聚甲醛固定，包埋，制作4 μm厚石蜡切片，HE染色，光学显微镜×400放大视野下对心肌组织进行分析。

2.4 TUNEL染色先制作石蜡切片，再参照试剂盒说明书进行TUNEL染色，细胞核DAPI复染。荧光显微镜下正常细胞示蓝色，阳性凋亡心肌细胞示红色。每张玻片选5个非重复视野，计数阳性细胞个数。

2.5 免疫组化取材同HE染色，参照之前文献的方法[5]，将病理切片常规脱蜡、修复并消除内源性过氧化物酶，PBS液冲洗后，加入抗caspase-3、Bax、Bcl-2的一抗，置4 ℃孵育12 h后，PBS冲洗清除表面杂质和一抗；加入羊抗兔二抗，常温孵育15 min后，加入DAB显色液孵育3 min，显微镜下观察，阳性细胞呈现黄色或者棕黄色。每张玻片选5个非重复视野，计数caspase-3、Bax、Bcl-2阳性细胞个数。

2.6 免疫印迹取心尖部心肌组织制成组织匀浆后，RIPA细胞裂解液裂解蛋白，应用经典的BCA法测定浓度并制作标准曲线。取30 μg总蛋白，94 ℃变性3 min后，进行12% SDS-PAGE电泳，转移到PVDF膜，用含5%脱脂乳的TBS缓冲液封闭1 h，添加caspase-3、Bax、Bcl-2、TLR4、TN-C、NF-κB p50、NF-κB p65等一抗，4 ℃孵育12 h。PBS液冲洗3次，二抗(1∶2 000稀释)孵育1 h后，TBST洗膜，暗室曝光显影。计算并记录各样本蛋白与β-actin相对灰度值。

2.7 实时定量PCR(qPCR)检测根据RNA提取试剂盒操作说明，提取心肌组织总RNA，NanoDrop-ND2000紫外超微分光光度计基于260 nm/280 nm比值监控质量，取1 μL RNA，用RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0试剂盒逆转录为cDNA。IL-1、IL-6、NF-κB p50和NF-κB p65基因的mRNA表达采用TaqMan市售水解探针检测，PCR扩增条件：94 ℃，2 min(预变性)；95 ℃，30 s(变性)；65 ℃，30 s(退火)；60 ℃，30 s(延伸)；40个循环。记录各个反应的Ct值，以β-actin基因为内参，ΔΔCt法分析结果，按照公式2-ΔΔCt计算各基因相对于β-actin内参基因的表达水平。引物序列见Tab 1。

3 结果

3.1 PKD1对心梗大鼠血流动力学的影响Tab 2结果显示，与Sham组相比，模型组大鼠EDV和ESV值明显升高(P<0.01)，而Max dp/dt和Min dp/dt值明显降低(P<0.01)；与模型组相比，PKD1治疗组大鼠EDV和ESV值明显降低(P<0.01)，而Max dp/dt和Min dp/dt值明显升高(P<0.01)；PKD1组和模型组Tau值均明显低于Sham组，但两组间无统计学差异。提示PKD1可改善EDV、ESV、Max dp/dt、Min dp/dt等血流动力学参数，对Tau没有影响。

3.2 PKD1对心梗大鼠组织形态学的影响Fig 1的HE染色结果表明，Sham组大鼠组织结构规则、红色心肌组织清晰，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠心肌组织坏死比例较高，炎性细胞浸润和成纤维细胞增生明显；PKD1治疗组大鼠心肌组织恢复较好，细胞核较为清晰，少见炎性细胞浸润，但细胞核仍显肥大。

Tab 1 Sequence of PCR primer

Tab 2 Effect of PKD1 on hemodynamics in rats with myocardial infarction n=15)

Fig 1 Effects of PKD1 on histomorphology of myocardial infarction rats(HE, ×400)

3.3 PKD1对心梗大鼠心肌细胞凋亡的影响Fig 2的TUNEL染色分析表明，Sham组和PKD1组大鼠心肌细胞主要发出蓝色荧光，个别细胞发出红色荧光，模型组大鼠心肌细胞主要呈红色荧光。细胞计数结果表明，Sham组和PKD1组大鼠呈红色荧光的阳性凋亡细胞个数均明显少于模型组(P<0.01)。免疫组化和Western blot结果均表明(Fig 2、3)，模型组大鼠心肌组织中caspase-3、Bax表达明显高于Sham组，而Bcl-2表达明显低于Sham组(P<0.01)；PKD1治疗后，大鼠心肌组织中caspase-3、Bax表达较模型组明显降低(P<0.01)，而Bcl-2表达明显升高(P<0.01)。提示PKD1治疗可有效对抗心梗大鼠心肌组织受损后引起的心肌细胞凋亡。

3.4 PKD1对心梗大鼠心肌组织中炎症反应调控蛋白表达的影响Fig 4的结果证实，PKD1干预可明显下调模型组大鼠因心肌缺血损伤引起的TLR4、TN-C、NF-κB p50和NF-κB p65的表达升高(P<0.01)。表明PKD1给药可有效抑制心梗大鼠心肌组织中的炎症反应。

3.5 PKD1对心梗大鼠心肌组织中炎症因子mRNA表达的影响如Fig 5所示，PKD1干预可明显下调模型组大鼠因损伤所致的致炎因子IL-1、NF-κB p50和NF-κB p65的mRNA表达升高(P<0.01)，但PKD1组和模型组间IL-6 mRNA表达没有统计学差异。表明PKD1可下调IL-1、NF-κB p50、NF-κB p65 mRNA表达，但不影响IL-6 mRNA表达。

4 讨论

本研究利用大鼠心肌梗死模型，评价PKD1在心肌梗死心肌组织损伤中的抗炎、抗凋亡作用。研究发现，PKD1治疗1周可有助于减轻心肌梗死后缺血心肌组织中的炎症和凋亡反应。

ESV和Max dp/dt反映心脏的收缩功能，EDV和Min dp/dt反映心脏的舒张功能。PKD1可明显降低ESV和EDV的值，同时上调Max dp/dt和Min dp/dt的值。表明PKD1干预可改善心肌的顺应性，提高心功能指标，在改善心梗大鼠心肌组织的血流动力学方面效果明显。HE染色结果表明，心肌梗死后组织坏死和炎性细胞浸润明显，PKD1治疗可明显减轻心肌组织的坏死程度，但心肌细胞仍明显肥大，这可能与用药时间较短有关，也可能是PKD1并不明显抑制心肌肥大。

TUNEL染色结果表明，心肌梗死后出现大量凋亡的心肌细胞，而PKD1治疗可有效抑制心肌细胞的凋亡。免疫组化和免疫印迹结果均表明，心肌梗死后，心肌组织内caspase-3、Bax的表达明显升高，Bcl-2的表达明显降低，而PKD1治疗可有效抑制caspase-3、Bax的上调，并促进Bcl-2的表达上调。文献研究表明[7-8]，caspase-3、Bax的表达增多，而Bcl-2表达减少意味着组织损伤的加重和细胞凋亡数量的增多；反之，则表明损伤的减轻和凋亡细胞数量的减少。从本实验结果分析，PKD1治疗能有效抑制心梗后心肌细胞的凋亡。

心肌梗死后引发缺血损伤的起始阶段，很多炎症因子被损伤刺激激活，趋向至损伤区域[9]。在这一阶段，炎症白细胞，如单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞数量激增。TLRs是心肌缺血损伤后白细胞表达的模式识别受体[10]，也是一种重要的炎症反应调控蛋白，可调控NF-κB的转运，或者影响炎性细胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α等的释放反应[11]。同时，损伤反应也会刺激诱导炎症白细胞释放更多的炎症细胞因子，激发规模更大的炎症反应，致使梗死范围进一步扩大[12]。其中，IL-1不仅可导致心肌梗死后炎症反应加重，还可引发心肌细胞凋亡、纤维化、心肌肥厚等不良后果[13]。心肌细胞凋亡又会进一步导致补体系统和TLRs的激活，并生成大量的氧自由基，进而激活心肌细胞核因子NF-κB，诱发趋化因子、细胞因子或黏附分子生成增多[14]。缺氧、活性氧以及TNF-α、IL-1介导的炎性刺激，均可激活NF-κB[14]。在细胞核中，NF-κB p50/RelA及NF-κB p65可诱导激发IL-1、IL-6、TNF-α、急性期反应蛋白以及黏附分子ICAM-1和YCAM1等的生成增多，参与炎症反应的进程[14]。而且心肌梗死小鼠NF-κB p50基因敲除后，心室重塑可以被逆转[14]。因此，就本研究结果来看，PKD1治疗的有益作用可能与其下调TLR4、IL-1、NF-κB p50和NF-κB p65的表达密切相关，进而逆转心室重塑和改善心肌功能。本研究还发现，PKD1干预不改变IL-6的表达水平，这可能是PKD1对炎性细胞因子的作用具有一定的选择性。

Fig 2 Effect of PKD1 on apoptosis of myocardial cells in rats with myocardial infarction vs sham group;##P<0.01 vs model group

Fig 3 Effect of PKD1 on expression of apoptotic regulatory protein in myocardial tissue of rats with myocardial infarction

Fig 4 Effect of PKD1 on expression of inflammatory regulatory protein in myocardial tissue of rats with myocardial infarction

Fig 5 Effects of PKD1 on mRNA expression of inflammatory factors in myocardium of rats with myocardial infarction

TN-C也属于炎症的重要标志物之一，其本身属于一种基质细胞蛋白，参与新胶原分子的形成，并具有调节NF-κB活化的作用[15]。敲除TN-C基因可下调心肌梗塞后心肌组织胶原纤维的占比，增强心肌的顺应性，抑制心衰的发生[14]。本实验发现，PKD1治疗可降低TN-C的表达水平，这可能是通过下调NF-κB p50和NF-κB p65表达而实现的。

以上研究表明，PKD1具有调节心肌梗死大鼠心肌组织的炎症反应，减轻梗死后心肌细胞凋亡，改善梗死后血流动力学参数，进而逆转心室重塑的潜在作用。