连翘败毒丸高效液相色谱指纹图谱研究及聚类分析

2019-09-16许翔

中国药业 2019年18期

许翔

（中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院药学科，福建福州 350000）

连翘败毒丸由连翘、金银花、黄连、黄芩、黄柏、赤芍等19味中药材组方，有清热解毒、散风消肿功效，临床主要用于治疗脏腑积热与风热湿毒引起的疮疡初起、红肿疼痛、憎寒发热、风湿疙瘩、遍身刺痒、大便秘结[1]。本研究中建立了连翘败毒丸的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并结合聚类分析，为其质量控制和快速评价提供借鉴。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1200型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司，包括在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、VWD-G1314C型检测器、Chemistation数据处理系统）；AUW-220D型十万分之一电子天平（日本岛津公司）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）。

1.2 试药

连翘苷对照品（批号为 110821-201816，含量95.1%），连翘酯苷A对照品（批号为111810-201707，含量97.2%），绿原酸对照品（批号为110753-201817，含量96.8%），黄芩苷对照品（批号为110715-201821，含量95.4%），盐酸小檗碱对照品（批号为110713-201814，含量 86.7%），汉黄芩苷对照品（批号为112002-201702，含量98.5%），芍药苷对照品（批号为110736-201842，含量97.4%），均购于中国食品药品检定研究院；连翘败毒丸（承德天元药业股份有限公司，批号分别为 171019，171222，180126，180222，180319，180408，180513，180619，180910，181021，181107，181126，编号为 S1 ～ S12，规格为每袋 9 g）；乙腈、甲醇均为色谱纯，磷酸为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[2-3]

色谱柱：YMCHydrosphere-C18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.5% 磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～16 min、16%A→25%A，16～30 min、25%A→38%A，30～40 min、38%A→59%A，40～54 min、59%A→80%A，54～62 min、80%A→16%A）；流速：0.7 mL/min；检测波长：328（0～16 m），220 nm（16～40 min），277 nm（40 ～62 min）；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：分别称取连翘苷、连翘酯苷A、绿原酸、黄芩苷、汉黄芩苷、盐酸小檗碱、芍药苷的对照品各适量，精密称定，以甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为 2.245 6，2.001 7，1.113 4，0.582 7，0.511 9，1.201 2，0.894 1 mg/mL的混合对照品溶液，冷藏避光保存。

供试品溶液：取装量差异项下的内容物，研细，取约2.5 g，精密称定，置50 mL棕色容量瓶中，加入30 mL甲醇溶液，室温超声（功率450 W，频率40 kHz）处理40 min后取出，放冷，用甲醇定容，摇匀，滤过，即得。

2.3 HPLC指纹图谱的建立

方法学考察：按标准进行方法学考察，结果精密度、稳定性、重复性试验结果的RSD均小于2%，表明仪器精密度、方法重复性良好，供试品溶液室温放置24h内稳定。

指纹图谱的建立及相似度分析：取12批样品，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样，测定，得HPLC图谱，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012A版）软件，得HPLC指纹图谱，详见图1和图2。S1～S12号样品与对照图谱的相似度分别为0.989，0.971，0.967，0.992，0.909，0.981，0.988，0.974，0.979，0.994，0.993，0.989，均大于 0.9。在 23 个共有峰中，12号峰的面积最大，峰位居中，分离完全，通过与混合对照品图谱对照，指认出其为连翘苷，设为参照峰（S），计算其他共有峰对12号峰的相对峰面积。详见表1。

图1 12批样品HPLC叠加指纹图谱

图2 样品HPLC对照指纹图谱

共有峰指认：采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012A版）对12批样品的HPLC图谱进行比较分析。结果，可指认23个共有峰中的7个成分，分别为绿原酸（3 号峰）、芍药苷（8 号峰）、连翘苷（12 号峰）、连翘酯苷A（14号峰）、盐酸小檗碱（15号峰）、黄芩苷（19号峰）、汉黄芩苷（20号峰）。混合对照品色谱图见图3。

2.4 聚类分析[4-5]

将12批样品中23个共有峰的相对峰面积数据输入SPSS 22.0统计学软件，采用组间均联法，以欧氏距离平方为测度，采用系统聚类分析法进行模式识别分析，结果见图4。根据聚类分析树状图，当类间距介于15～25时，12批样品被分成了 3大类：S4、S10、S11为一类，S1、S2、S3、S6、S7、S8、S9、S12 为一类，样品 S5 单独为一类。聚类分析结果与相似度结果基本一致。

3 讨论

现行质量标准仅对连翘败毒丸的性状、大黄的薄层和丸项下的通则检查做了规定，难以全面评价其质量，文献报道鲜有对其综合质量的评价方法[6]。在中医药理论中，中成药的药效是各味药发挥协同作用的结果，指纹图谱可全面控制中药内在化学成分的整体质量，它是以色谱峰的相对保留时间及相对峰面积来进行定性，以色谱峰面积进行定量，可作为分析中药内部有效成分的技术[7-8]。

本研究中以12号峰（连翘苷峰）为参照峰，计算得的12批样品23个共有峰的相对保留时间的RSD为0.05% ～1.10%（文中表略），均较小；而相对峰面积的RSD为 0.06% ～4.72% ，其中 7，18，21，23 号峰大于2.0%，峰面积的差异可能与原料药材质量有关，不同产地和来源的药材质量有很大差异，建议药厂在选药投料生成前应注意药材成分含量的检测。

本研究中曾采用二极管阵列检测器行全波长扫描，为了实现连翘苷、连翘酯苷A、绿原酸、黄芩苷、汉黄芩苷、盐酸小檗碱、芍药苷的同时测定，采用不同时段切换不同检测波长：0～16 min时，在328 nm波长处测定绿原酸；16～40 min时，在220 nm波长处检测连翘苷、连翘酯苷A及芍药苷；40～62 min时，在277 nm波长处检测黄芩苷、汉黄芩苷、盐酸小檗碱。同时比较了乙腈和甲醇作为有机相，0.1%磷酸溶液、0.3%磷酸溶液、0.5%磷酸溶液及水作为无机相的检查效果，结果表明，以乙腈-0.5%磷酸溶液系统得到的指纹图谱色谱峰数量多、信号强、分离效果好。研究过程中还比较了超声提取、加热回流提取及浸渍过夜提取3种提取方法的差异，结果提取率无明显差异，但超声提取时间短、操作简便，故为了节约成本采用超声提取法。

综上所述，本研究中建立了连翘败毒丸HPLC指纹图谱，实现了对其多指标成分整体、综合的客观评价与分析，共识别出23个共有峰，并指认出其中7个指标性成分，能较好地反映出连翘败毒丸内在质量信息，可为有效控制连翘败毒丸的质量提供科学依据。