HPLC法测定霍山石斛中夏佛塔苷、异夏佛塔苷的含量

2019-09-13杨丽娥叶家宏周楚娟梁芷韵黄月纯顺庆生魏刚

广州中医药大学学报 2019年9期

杨丽娥，叶家宏，周楚娟，梁芷韵，黄月纯，，顺庆生，魏刚

（1.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510006；3.上海健康职业技术学院，上海 200237；4.广州中医药大学中药学院，广东广州 510006）

霍山石斛Dendrobioum huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng是兰科植物石斛属多年生草本植物，主要分布于我国安徽省霍山县，因其初出时“形如累米”又被称为米斛[1]。霍山石斛，最先见载于清·赵学敏《本草纲目拾遗》一书中，具有益智、益精强阴、轻身延年、厚肠胃、平胃气、长肌肉等功能[1]。石斛药用种类虽然众多，但霍山石斛以其绝佳的内在品质，备受历代医家推崇[2]。

由于霍山石斛在自然生长环境下发芽率很低，加上长期以来无限制地采挖，霍山石斛的野生资源已难觅踪迹[3]。目前，霍山石斛在安徽省霍山县及邻近地区具有小规模的栽培面积，但仍然供不应求，价格相当昂贵。在市场需求的驱使下，它的伪品也种类繁多[4，5]，在霍山当地常见以铁皮石斛、细茎石斛冒充混淆霍山石斛，广东地区常见美花石斛加工冒充霍山石斛。由于正品样品来源的缺乏，目前尚未有比较可靠、完善的霍山石斛质量控制指标。本课题组前期进行了霍山石斛高效液相色谱（HPLC）特征图谱的研究，拟定了黄酮类成分指标群[6]，后续研究中利用超高效液相色谱——电喷雾——多级质谱（UHPLC-ESI-MSn）对其结构进行解析，确定了22个黄酮苷类化合物，其中包括新西兰牡荆苷Ⅱ、新西兰牡荆苷Ⅰ、新西兰牡荆苷Ⅲ、夏佛塔苷、异夏佛塔苷以及金圣草素为苷元的黄酮苷类成分，对鉴别霍山石斛的真伪具有一定意义[7]。黄酮类化合物是霍山石斛中除多糖外的另一类主要成分，但目前仍缺乏对霍山石斛黄酮类成分含量测定方法的研究。为提供新的霍山石斛质量控制方法，本研究通过液质方法鉴别了霍山石斛的2个黄酮碳苷类成分，分别为夏佛塔苷和异夏佛塔苷，并建立一种同时测定霍山石斛中夏佛塔苷和异夏佛塔苷含量的方法，现将研究结果报道如下。

1 材料

1.1仪器与试剂LCQ Fleet离子阱液质联用仪（美国赛默飞公司）；Agilent 1200高效液相色谱仪（四元泵、柱温箱、二极管阵列检测器和Agilent 1200色谱工作站）（美国Agilent公司）；MS 204S（d=0.1 mg）电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；MS 105DU（d=0.01 mg）电子天平（瑞士 Mettler Toledo公司）。乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为纯化水。

1.2试药夏佛塔苷（纯度≥92.5%，购自中国食品药品检定研究院，批号：111912-201302）；异夏佛塔苷（含量≥99%，购自上海融禾医药科技发展有限公司，批号：121024）；1批野生霍山石斛（编号：HS-1）及10批栽培霍山石斛（编号：HS-2～HS-11）由九仙尊霍山石斛股份有限公司提供，经顺庆生教授鉴定系霍山石斛Dendrobioum huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng的茎，于60℃条件下减压烘干，备用。

2 方法与结果

2.1 HPLC-MS鉴别霍山石斛夏佛塔苷与异夏佛塔苷成分

2.1.1 质谱条件 m/z扫描范围：50～600；干燥气温度：300℃；Sheath Gas流速：45 L·min-1；Aux Gas流速：15 L·min-1；离子化方式：ESI（+）和ESI（-）；电喷雾电压：3 000 V。

2.1.2 色谱条件色谱柱为Zorbax SB-Aq（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流速为1 mL·min-1，柱温为30℃，检测波长为340 nm，流动相为乙腈（A）——体积分数为0.4%的甲酸溶液（B）（V∶V=15∶85），进样量为5 μL。

2.1.3 对照品溶液的制备取夏佛塔苷和异夏佛塔苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 mL含夏佛塔苷302 μg、异夏佛塔苷368 μg的对照品溶液。

2.1.4 供试品溶液的制备取霍山石斛粉末（过4号筛）1.0 g，精密称定，加甲醇50 mL，回流提取4 h，取出，放冷；滤过，滤液减压蒸干，残渣加甲醇使溶解，置2 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.5 结果与分析化合物1与化合物2在正离子模式中分子离子峰均为m/z 565[M+H]+，负离子模式分子离子峰均为m/z 563[M-H]-，则两者为相对分子量564的一对同分异构体。在负离子模式二级质谱中，出现m/z 503[（M-H）-60]-、m/z 473[（M-H）-90]-、m/z 443[（M-H）-120]-、m/z 383[（M-H）-90-90]-和m/z 353[（M-H）-90-120]-等碎片离子，则该化合物为芹菜素为苷元的双糖碳苷。化合物1中相对丰度[（M-H）-60]-＜50%，化合物2中相对丰度[（M-H）-60]-＞50%，结合对照品色谱保留时间（tR）、紫外吸收光谱特征，故鉴定化合物1、2分别为夏佛塔苷、异夏佛塔苷。结果见图1～3。

2.2霍山石斛夏佛塔苷与异夏佛塔苷含量的测定

2.2.1 色谱条件色谱柱为Zorbax SB-Aq（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流速为1 mL·min-1，柱温为30℃，检测波长为340 nm，流动相为15%体积分数的乙腈（A）——体积分数为0.4%的甲酸溶液（B），等度洗脱0～25 min，进样量为5 μL。

2.2.2 供试品溶液的制备精密称定霍山石斛粉末（过四号筛）1.0 g，精密加入甲醇50 mL，浸泡过夜，水浴加热回流4 h，取出，放冷至室温，滤过，用甲醇适量洗涤滤渣，合并滤液至圆底烧瓶中，减压浓缩至约2 mL，转移至2 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.3 对照品溶液的制备精密称定夏佛塔苷和异夏佛塔苷对照品适量，加甲醇分别制成每1 mL含夏佛塔苷292 μg、异夏佛塔苷482 μg的对照品储备液。

2.2.4 专属性考察分别取夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品，配制成含夏佛塔苷、异夏佛塔苷的混合对照液，另准备一份甲醇作为空白对照。按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，结果见图4。

2.2.5 线性关系考察分别精密吸取夏佛塔苷和异夏佛塔苷对照品储备液 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2 mL置5 mL容量瓶中，分别加甲醇至刻度，摇匀，即分别得夏佛塔苷和异夏佛塔苷不同梯度浓度的对照品溶液。分别依次进样，按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积。以对照品浓度[ρ/（μg·mL-1）]为横坐标X，色谱峰面积（A）为纵坐标Y，进行线性回归。结果见表1。

图1 夏佛塔苷的正/负离子二级质谱图（A/B）Figure 1 Secondary mass spectrogram of the positive/negative ions of schaftoside（A/B）

图2 异夏佛塔苷的正/负离子二级质谱图（A/B）Figure 2 Secondary mass spectrogram of the positive/negative ions of isoschaftoside（A/B）

2.2.6 精密度试验精密吸取同一供试品溶液5μL，连续进样6次，6次检测结果夏佛塔苷平均峰面积为456.3，相对标准偏差（RSD，sR）为1.00%，异夏佛塔苷平均峰面积为668.0，sR为1.27%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液（HS-1）5 μL，分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样测定。结果显示：夏佛塔苷平均峰面积为459.9，sR为0.94%；异夏佛塔苷平均峰面积为674.2，sR为0.95%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.8 重复性试验取同一批样品（HS-1）6份，分别制备供试品溶液，进样分析，记录峰面积。结果显示：夏佛塔苷平均含量为0.088 0 mg/g，sR为1.80%；异夏佛塔苷平均含量为0.146 9 mg/g，sR为1.92%。表明方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验精密称取已知含量的霍山石斛（HS-1）药材粉末0.50 g，分别精密加入夏佛塔苷对照品溶液（84.6 μg/mL）、夏佛塔苷对照品溶液（142.8 μg/mL）各0.5 mL，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果见表2。

2.2.10 样品的测定取不同批次的霍山石斛样品，按照“2.2.2”项下方法制备样品溶液，按“2.2.1”项下的色谱条件测定，计算夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量，结果见表3。

3 讨论

本研究比较了Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Zorbax SB Aq柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Zorbax SB C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）的分离效果，结果显示以Zorbax SB-Aq柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）的分离效果较好。考察了不同柱温（25、30、35℃）对分离效果的影响，结果显示以30℃效果最优，方法学符合相关要求。在供试品溶液的制备方面，比较了提取方法（超声提取和回流提取）、提取溶剂（80%甲醇、90%甲醇、100%甲醇）及提取时间（3、4、5 h）对夏佛塔苷和异夏佛塔苷提取率的影响，结果显示回流提取效果较好，而且浓缩处理较方便，最终确定采用甲醇回流提取4 h。

图3 夏佛塔苷（A）、异夏佛塔苷（B）对照品和霍山石斛样品（C）HPLC-UV图谱（340 nm）Figure 3 HPLC-UV chromatograms of schaftoside（A），isoschaftoside（B）references and Dendrobium huoshanense sample（C）（340 nm）

图4 霍山石斛中夏佛塔苷和异夏佛塔苷专属性HPLC对照图谱Figure 4 HPLC comparison of the specificity of schaftoside and isoschaftoside in Dendrobium huoshanense

表1 线性关系考察结果Table 1 The results of linear relationship

本课题组前期利用UHPLC-ESI-MSn对霍山石斛[7]和紫皮石斛[8]进行黄酮类化合物的结构解析，其中紫皮石斛确定了13个黄酮苷类化合物，包括新西兰牡荆苷Ⅱ、新西兰牡荆苷Ⅰ、夏佛塔苷、异夏佛塔苷等以芹菜素为苷元的黄酮碳苷，以及芦丁、槲皮素-7-O-芸香苷、山柰酚-3-O-芸香苷、山柰酚-7-O-芸香苷等以槲皮素、山柰酚为苷元的黄酮氧苷，而霍山石斛确定了包括新西兰牡荆苷II、新西兰牡荆苷I、新西兰牡荆苷III、夏佛塔苷、异夏佛塔苷、柚皮苷以及以金圣草素为苷元的黄酮苷类成分等22个黄酮苷类化合物，其中有11个为首次从该属植物中分离得到。霍山石斛与紫皮石斛的黄酮苷类成分不完全相同，并且在霍山石斛黄酮类成分HPLC图谱研究中发现，夏佛塔苷与异夏佛塔苷色谱峰面积在总黄酮类成分色谱峰面积中占有较大比例，说明霍山石斛中夏佛塔苷与异夏佛塔苷相对含量较高。而在紫皮石斛中夏佛塔苷、异夏佛塔苷、新西兰牡荆苷Ⅱ与新西兰牡荆苷Ⅰ、含量呈正相关[9]。由此可通过夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量测定为霍山石斛提供新的质量控制方法。