新疆伊犁地区乳品中发酵菌种的筛选及产酸性能研究

张亚川，蔡静静，剡文莉，王丽军，倪永清

（石河子大学食品学院食品生物技术实验室，新疆石河子832000）

0 引言

伊犁州是我国重点牧区之一[1]。当地居民制作的传统乳制品中蕴藏着丰富的乳酸菌资源。许多学者对新疆传统乳制品中的乳酸菌进行了研究，董晓婉等[2]从新疆和布克赛尔县25份传统酸乳中分离出40株乳酸菌。刘洁洁等[3]从阿勒泰地区传统乳制品中分离出11株乳酸菌。马燕等[4]从伊犁、石河子地区分离出104株乳酸菌。

传统的乳酸菌鉴定方法依赖于表型分析[5]。16S rDNA是细菌分类研究中最常用的分子钟[6]。随着分子生物学技术的发展，使用16SrRNA序列分析方法鉴定LAB越来越普遍。

我国不同区域的自然发酵乳品承载了当地丰富的微生物资源，因此应深入研究并从中筛选出优良乳酸菌用于工业化生产[7]。伊犁地区传统乳制品中微生物数量众多，对其中优良发酵菌株的开发能够为酸乳发酵剂的制作提供菌株。

1 实验

1.1 材料及试剂

（1）实验样品。采自新疆伊犁地区的传统奶制品。

（2）培养基。MRS肉汤培养基，用于乳杆菌的富集；MRS固体培养基（MRS肉汤添加1.7%的琼脂），用于乳杆菌的分离筛选；M 17肉汤培养基，用于乳球菌的富集；M 17固体培养基（M 17肉汤添加1.7%的琼脂），用于乳球菌的分离筛选。上述培养基121℃灭菌15 min使用。质量分数为12%脱脂乳培养基，95℃灭菌5 min使用。

（3）试剂。Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit，PCR扩增体系所需试剂以及扩增引物。

1.2 仪器

恒温生化培养箱，PCR仪，水平电泳仪为，电泳槽，凝胶成像系统等。

2 方法

2.1 乳酸菌的分离鉴定

2.1.1 乳酸菌的分离纯化

样品用无菌生理盐水稀释至10-4，10-5，10-6；吸取100 L稀释后的样品均匀的涂布在MRS、M 17培养基上[8]。观察菌落颜色、大小、凸起程度和光泽度，挑选其中具有乳酸菌典型特征的单菌落进行富集。取适量菌悬液进行镜检，若镜检中菌株细胞形态、排列方式不一致，则需继续划线纯化至一致。纯化后的菌株37℃条件下培养18 h后进行革兰氏染色。将革兰氏阳性菌株富集后以2%的接种量接种到12%的灭菌脱脂乳中37℃培养，具备凝乳特性的菌株保藏至-80℃备用。

2.1.2 生理生化实验

参照“东秀珠”等《常见细菌鉴系统定手册》[9]。

2.1.3 乳酸菌16SrRNA序列分析

（1）菌株DNA的提取。菌体DNA的提取采用Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit试剂盒，使用试剂盒所提供的药品按照说明书步骤提取DNA。

（2）16S rRNA序列扩增。扩增引物采用乳酸菌通用引物，上游引物27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游引物1492R：5′-TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。

PCR扩增体系（25 L体系）：预混液2×Taq MasterMix 12.5 L，引物27F 0.5 L，引物1492R 0.5 L，DNA模板2 L，补充ddH2O至25 L。PCR反应条件：94℃预变性5 min；95℃变性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃终延伸7 min；4℃保存备用。

（3）PCR扩增产物检测。PCR扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检测，100 V电泳40 min，凝胶成像仪下采集图像。

（4）系统发育分析。菌株16S rRNA序列扩增成功后，委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，将测序结果在NCBI数据库进行BLAST在线分析。将测序菌株以及模式菌株的16SrRNA序列经Clustal X多重比对后，运用MEGA 6.0软件对各菌株的系统发育地位进行分析。

2.2 发酵菌种的筛选

2.2.1 凝乳时间的确定

将37℃条件下培养18 h的乳酸菌在转速为4 000 r/min下离心10 min后，弃去上清液并用灭菌生理盐水洗涤，反复洗涤3次后用生理盐水将离心菌体重悬。以2%的接种量将菌种接种于灭菌脱脂乳中，置于37℃恒温培养至其凝乳，保存至4℃冰箱作为发酵剂备用[10]（以下实验所用酸奶发酵剂均按此方法制备）。将单菌株发酵剂以2%的添加量接种于灭菌脱脂乳中，置于37℃下恒温培养，每隔1 h检查凝乳状况，待样品凝乳后记录凝乳时间，并将酸乳置于4℃冷藏柜保藏待用。

2.2.2 酸度测定

取5.0 g冷藏的发酵乳样品于100 mL锥形瓶中，加入40 mL煮沸蒸馏水混合均匀，并加入5滴0.5%的酚酞指示剂，用0.1 mol/L的标准氢氧化钠溶液滴定至粉红色，1 min内不变色。记录氢氧化钠的消耗量及酸乳的质量[11]，其计算公式为

式中：X1为试样的酸度；C1为氢氧化钠浓度；V1为样品消耗氢氧化钠体积；V0为空白消耗氢氧化钠体积；100为100 g试样；M1为试样的质量；0.1为酸度理论定义氢氧化钠的浓度。

2.2.3 感官评定

邀请10名食品专业的研究生对冷藏24 h的发酵乳从色泽、风味、组织状态方面进行感官特性评价，各项总分为色泽10分、风味40分、组织状态50分。取出冷藏酸乳观察其组织状态和色泽，再闻其气味，用纯净水漱口后，品尝样品的滋味，并记录对应项得分。

2.3 菌株产酸性能

2.3.1 生长性能

采用比浊法测定菌株的生长曲线。活化后的菌株以2%的接种量接种于装有150 mL液体MRS培养基的200 mL锥形瓶中，37℃条件下培养30 h，每隔2 h测其OD600值。绘制OD600值与培养时间的曲线[12]。

2.3.2 菌株产酸能力

单菌株发酵剂以2%的接种量接种于脱脂乳中，37℃恒温培养，每隔2 h取出样品测其滴定酸度，直至滴定酸度趋于稳定。绘制酸乳发酵过程中酸度随时间变化的曲线。酸度测定方法以及发酵剂制备方法见上述。

2.3.3 菌株后酸化能力

单菌株发酵剂以2%的接种量接种于灭菌脱脂乳中，发酵至终点后将发酵乳取出置于4℃保藏，分别于第1，5，10，15，20 d取出测其滴定酸度。酸度测定方法以及发酵剂制备方法见上述。

3 结果与讨论

3.1 乳酸菌的分离鉴定

3.1.1 乳酸菌的分离纯化

从采集的酸牛乳、酸驼乳以及奶酪中初步分离出具有明显乳酸菌特征的菌株71株，其中具有产酸凝乳特性的乳酸菌8株，8株乳酸菌的显微镜检图片以及菌体形态特征如图1和表1所示。

图1 乳酸菌显微特征

表1 菌落形态以及菌株形态表征

3.1.2 生理生化实验

8株乳酸菌的生理生化结果如表2所示。由表2可以看出，8株乳酸菌接触酶实验、明胶液化实验、硫化氢实验、硝酸盐还原实验、运动性实验的结果均为阴性。糖醇发酵实验中，所有菌株均能利用葡萄糖和乳糖发酵产酸；果糖实验中，只有菌株BLK7-10和BLK7-12呈 阴 性；菌 株 BLK7-10，BLK7-12，XKN 1-5，BST 4-1可以利用蔗糖发酵产酸；菌株BLK7-10，XKN 1-5，BST4-1可以利用麦芽糖发酵产酸；阿拉伯糖发酵实验中，只有菌株BLK7-10呈阳性。菌 株BLK7-10，BST 4-1，BST 2-3，BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4与乳杆菌的特征相似，初步判断上述6株菌为乳杆菌。菌株XKN 1-5和BLK7-12与乳球菌的特征相似，初步判断菌株XKN 1-5和BLK7-12为乳球菌。

表2 生理生化鉴定

图2 PCR产物凝泳胶电图

3.1.3 16SrRNA序列分析

所筛选菌株的PCR扩增产物如图2所示。由图2可以看出，所有菌株的PCR扩增产物均在1 500 pb左右出现特异性扩增带，与预期大小相符，说明扩增成功。将8株菌的PCR产物送至上海生工生物科技有限公司完成相关测序工作。

3.1.4 系统发育分析

将8株乳酸菌的部分16SrRNA基因序列将测序结果在NCBI数据库进行BLAST在线分析，比对结果如表3所示。选取同源性最高的序列构建系统发育树，系统发育树如图3所示，由图3可以看出，7株乳酸菌属于Lactobacillus，Leuconostoc，Enterococcus三个属；其中菌株BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4与Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus 57-1，Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus 9-4，Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus YLj15在一个分支上，且相似度达到99%，可确定3株菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种；菌株BLK7-10与Lactobacillus kefiranofaciens KF16在一个分支上；菌株BLK7-12与Enterococcus faecalis G1在同一分支上，且相似度高达99%，判定菌株BLK7-12为粪肠球菌；菌株XKN 1-5与Leuconostoc lactis MYSN 98在同一个分支上，相似度达99%，判定菌株XKN 1-5为乳酸明串球菌；菌株BST4-1、BST2-3分别于Lactobacillus plantarum AS-6、Lactobacillus fermentum LDTM在同一分支上，相似度均达100%，判定两株菌分别为植物乳杆菌和发酵乳杆菌。

3.2 发酵剂菌种的筛选

（1）发酵时间。在酸乳生产过程中，如果凝乳时间太短，不利于酸乳香味的生成，也会对酸乳的组织状态产生影响。凝乳时间过长，虽然对状态和香味有一定作用，但不利于节约生产能源和时间，也易造成发酵过程中的杂菌污染[13]。由表4可以看出，大部分乳酸菌的凝乳时间在17 h以下，菌株BST4-1发酵时间为32 h，发酵时间过长，不满足发酵需求。

（2）滴定酸度。由表4可以看出，8株乳酸菌的滴定酸度均在60～90°T，GB19302-2010规定酸乳酸度应大于70°T[14]，但是由于后期要进行菌株复合发酵，故酸度满足生产要求。

（3）感官评价。由8株乳酸菌发酵制成的酸乳色泽较为良好，均呈现乳白色或微黄色，其中菌株BSTS6-4的色泽最好；菌株BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4，XKN 1-5均具有酸牛奶特有的风味且无苦涩味；菌株BLK7-12，BLK7-10，BST2-3虽然有酸牛奶特有的风味但由略微的涩味；菌株BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4发酵制得的酸乳质地细腻、表面光滑、无裂缝；菌株BLK7-10，BST 2-3，XKN 1-5发酵制得的酸乳有轻微的乳清析出。菌株BLK7-12制得的酸乳有乳清析出且分层，凝乳状态差，不满足需求。

图3 菌株16SrRNA基因序列的系统发育树

表3 菌株系统发育相似性分析

表4 发酵菌种筛选结果

3.3 菌株产酸性能研究

3.3.1 菌株生长曲线

由图4可以看出，大部分菌株在培养4 h后进入对数生长期，18 h左右进入稳定期。菌株BLK7-10培养至24 h后才有缓慢生长，生长周期过长，不符合工业生产需求。除菌株BLK7-10外，其他5株乳酸菌在培养18 h后菌悬液OD 600值均能达到1.3以上，生长性能 良 好，菌 株 BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4，XKN 1-5，BST2-3的最佳收获时间为18～20 h。

3.3.2 菌株产酸能力

菌株产酸速率是评价酸乳发酵剂的一项重要指标，快速的酸化不仅对成品的香气、质构和感官特性有重要影响，也能有效防止酸乳污染[15]。由图5可以看出，菌株XKN 1-5产酸速率最快，20 h内酸度可达到112.86°T，菌株BSTS6-4在20 h内酸度由24.44°T上升到99.48°T，产酸速率较快。菌株BSTS6-1在20 h内，酸度由27.29°T上升到94.31°T，菌株BSTS6-3在20 h酸度由28.51°T上升至97.65°T。菌株BST2-3和BLK7-10产酸速率较慢，实际生产中易造成酸乳污染，产生不必要的经济损失。

图4 菌体密度变化曲线（OD600值）

图5 发酵过程中乳酸菌酸度的变化

3.3.3 菌株后酸化能力

后酸化使得酸乳在冷藏过程中过酸甚至产生苦味，不仅会产生让消费者难以接受的风味，也会降低产品的货架期。酸乳生产中常使用后酸化能力较弱的菌株来降低后酸化对酸乳的影响[16]。由图6可以看出，8株乳酸菌在20 d冷藏过程中酸度均有所升高，其中菌株XKN 1-5酸度变化最大，冷藏过程中酸度增加了24.18°T，后酸化能力较强，可能会造成酸乳风味的改变以及货架期的降低；菌株BLK7-10在冷藏过程中酸度增加了3.9°T，酸度变化最小，这可能与其自身产酸速率较低有关；菌株BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4，BST 2-3在冷藏过程中酸度增加量较为适度，不会对酸乳的品质造成影响。

图6 冷藏过程中酸乳酸度的变化

4 结论

从新疆伊犁地区采集的乳品中共分离出8株具有产酸凝乳性能的乳酸菌，其中菌株BSTS6-4，BSTS6-3，BSTS6-1为德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.b Lugaricus），菌株BLK7-10为开 菲 尔 乳 杆 菌（Lactobacillus kefiranofaciens），菌 株XKN 1-5为乳酸明串球菌（Leuconostoc lactis），菌株BLK7-12为 粪 肠 球 菌（Enterococcus faecalis），菌 株BST 2-3为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum），菌株BST 4-1为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。经过初筛得到6株凝乳时间短，酸乳组织状态良好、风味较佳的乳酸菌。通过对6株乳酸菌的生长性能、产酸性能进行分析对比，得到4株生长速度快、菌悬液浓度高、产酸速率高的乳酸菌XKN 1-5，BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4。后酸化实验表明，菌株XKN 1-5在冷藏过程中酸度变化较大，可能会造成酸乳在冷藏过程中的酸败变质，不利于酸乳的后期储存，不符合工业生产需求。菌株BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4后酸化能力较弱，在冷藏过程中酸度变化较小，因此菌株BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4将作为备选菌株应用到后期的复合发酵实验。