沙门氏菌快速检测培养基的优化

祝朝霞，李春梅，王丹，刘鹏，贾晨，刘磊

(1.黑龙江东方学院食品与环境工程学部，哈尔滨150066；2.黑龙江省绿色食品科学研究院，哈尔滨150028；3.北京良润生物科技有限公司，北京102200)

0 引言

沙门氏菌是一类菌型繁多、对人类和动物有极大危害的革兰氏阴性肠杆菌[1-2]。沙门氏菌是引起食物中毒和肠道腹泻的食源性致病菌之一，其引起的食物中毒病例位居首位[3-4]。目前的检测方法由传统检测法发展到免疫学、分子生物学和电化学等方法，但因上述检测方法操作繁琐、成本高，难以满足短保质期乳制品等食品生产后快速出厂致病菌的检测要求，因此快速检测测试片成为近年来的研究热点[5-6]。其原理是显色培养基是建立在细胞内生化反应的基础上，利用微生物特异性酶的特点，在培养基中添加相应的显色底物，使菌落呈现特点的颜色进而实现分离和鉴别微生物的目的[7-8]。

快速检测沙门氏菌的测试片是利用选择性培养基，冷凝胶和指示剂，根据酶与底物显色剂的显色反应，利用预制技术把培养系统集成到一个预制系统，开发出的一种沙门氏菌测试片产品。本文对选择性培养基和显色剂进行优化。

1 实验

1.1 材料

标准菌株：鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium），甲型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi A），乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），大肠埃希氏菌（Escherichia coli），肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae），产气肠杆菌（Enterobacteriaceae），阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae），福氏志贺菌（Shigella flexneri），宋氏志贺菌（Shigella sonnei），弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）。

主要试剂：氯化钠，丙酮酸钠，碳酸钙，牛胆盐，新生霉素，脱氧胆酸钠，均购于国药集团化学试剂有限公司；营养肉汤（蛋白胨、氯化钠、牛肉汤），BPW培养基（蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾），XLD培养基（酵母浸粉、L-赖氨酸、乳糖、蔗糖、去氧胆酸钠、柠檬酸铁胺、硫代硫酸钠、氯化钠、酚红），BS培养基（蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、煌绿、亚硫酸钠），均购于北京陆桥技术有限责任公司；5-嗅-4-氯-3-吲哚-辛酯溶液，购于美国Genview公司。

设备及仪器：MLS-33020CH型高压蒸汽灭菌锅（上海鼎谦生物科技有限公司），BT125D型电子分析天平（郑州南北仪器设备有限公司），SPX-250B型恒温培养箱（常州市华普达教学仪器有限公司），SW-CI-2G型生物超净工作台（苏州江东精密仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化

将沙门氏菌接种至营养肉汤，36℃150 r/min过夜振荡培养活化。活化后的沙门氏菌进行10倍梯度稀释，计数后保存在-4℃冰箱中备用。

1.2.2 促进剂优化

1.2.2.1 碳酸钙的单因素实验

以BPW为沙门氏菌测试片基础，分别添加的碳酸钙浓度为1 mg/L，2 mg/L，3 mg/L，4 mg/L，5 mg/L。接种沙门氏菌，做阳性对照，36±1℃培养24 h后进行菌落计数，考察碳酸钙浓度对沙门氏菌菌落总数的影响，每个浓度平行测定三次。

1.2.2.2 丙酮酸钠的单因素实验

以BPW为沙门氏菌测试片基础，分别添加的丙酮酸钠浓度为1 g/L，2 g/L，3 g/L，4 g/L，5 g/L。接种沙门氏菌，做阳性对照，36±1℃培养24 h后进行菌落计数，考察丙酮酸钠浓度对沙门氏菌菌落总数的影响，每个浓度平行测定三次。

1.2.2.3 促进剂的正交优化

参考单因素实验结果，以其用量为因素，进行2因素2水平的正交实验，平行测定三次，因素及水平见表1。考察各因素对沙门氏菌菌落总数的影响，确定最优促进剂组合的浓度。

表1 促进剂因素及水平

1.2.3 抑制剂优化

1.2.3.1 牛胆盐的单因素实验

以BPW为沙门氏菌测试片基础，分别添加的牛胆盐浓度为1 g/L，2 g/L，3 g/L，4 g/L，5 g/L。分别接种沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌，36±1℃培养24 h后进行菌落计数，考察牛胆盐浓度对三种菌株菌落总数的影响，每个浓度平行测定三次。

1.2.3.2 新生霉素的单因素实验

以BPW为沙门氏菌测试片基础，分别添加的新生霉素浓度为0.5 mg/L，1 mg/L，2 mg/L，5 mg/L，10 mg/L。分别接种沙门氏菌、大肠埃希氏菌、产气肠杆菌，36±1℃培养24 h后进行菌落计数，考察新生霉素浓度对三种菌株菌落总数的影响，每个浓度平行测定三次。

1.2.3.3 脱氧胆酸钠的单因素实验

以BPW为沙门氏菌测试片基础，分别添加的脱氧胆酸钠浓度为0.5 g/L，1 g/L，5 g/L，10 g/L，15 g/L。分别接种沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌，36±1℃培养24 h后进行菌落计数，考察脱氧胆酸钠浓度对三种标准菌株菌落总数的影响，每个浓度平行测定三次。

1.2.3.4 抑制剂的正交优化

参考单因素实验结果，以其用量为因素，进行3因素3水平的正交实验，平行测定三次，因素及水平见表2。考察各因素对沙门氏菌菌落总数的影响，确定最优促进剂组合的浓度。

表2 抑制剂因素及水平

1.2.4 显色底物剂量的确定

根据计数结果选择稀释度，快检培养基稀释活化后的菌株，分别添加0.05 g/L，0.1 g/L，0.15 g/L，0.2 g/L，0.3 g/L，0.4 g/L的5-嗅-4-氯-3-吲哚-辛酯，接种测试片，同时做阳性对照，平行测定三次，36±1℃培养。在24 h内观察测试片的显色情况，确定培养时间，通过观察菌落形态和菌落颜色评定显色效果，显色效果用“+”表示。

1.3 特异性验证

用无菌生理盐水对活化后的鼠伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、福氏志贺菌、宋氏志贺菌、弗氏柠檬酸杆菌进行10倍梯度稀释，制备成104CFU/mL菌悬液。用接种环取菌悬液在快速检测培养基上划线，于36±1℃培养18～24 h后观察结果。

1.4 食品检测、验证试验

从市场上采集各类乳制品等共计100份。由于国家对预包装食品进行严格把控，所以需对部分样品添加沙门氏菌。参照食品微生物学检验国家标准GB 4789.4-2016沙门氏菌检验，对样品中的沙门氏菌进行检验，分别在快速检测培养基（需前増菌）、国标BS、XLD培养基平板上进行对比分析[9]。

2 结果与分析

2.1 促进剂的实验结果与分析

2.1.1 碳酸钙的单因素分析

白世平等人的专利表明碳酸钙能显著促进沙门氏菌增长[10]。将单因素实验中丙酮酸钠的浓度设定为1～5 mg/L，其他培养条件不变，改变培养基中碳酸钙浓度对沙门氏菌生长的影响由图1可知，随着碳酸钙浓度逐渐升高，菌落总数呈上升趋势，当浓度达到2 mg/L时，菌落总数趋于稳定。经F检验和LSD两两比较，碳酸钙浓度在2 mg/L时的菌落总数与浓度为3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L时的菌落总数均不存在统计学差异（P＞0.05），从经济成本考虑，将2 mg/L作为正交实验中碳酸钙的中间浓度水平。

2.1.2 丙酮酸钠的单因素分析

图1 碳酸钙浓度对菌落总数的影响

钱红枚等人的研究表明丙酮酸钠能显著促进沙门氏菌生长[11]。将单因素实验中丙酮酸钠的浓度设定为1～5 g/L，其他培养条件不变，改变培养基中丙酮酸钠浓度对沙门氏菌生长的影响由图2可知，随着丙酮酸钠浓度逐渐升高，菌落总数呈上升趋势，当浓度达到3 g/L时，菌落总数趋于稳定。沙门氏菌在丙酮酸钠的浓度3 g/L时生长状态较优。经F检验和LSD两两比较，丙酮酸钠浓度在3 g/L时的菌落总数与浓度为4 g/L、5 g/L时的菌落总数均不存在统计学差异（P＞0.05），从经济成本考虑，将3 g/L作正交实验中丙酮酸钠的中间浓度水平。

图2 丙酮酸钠浓度对菌落总数的影响

2.1.3 促进剂正交实验分析

各促进剂对沙门氏菌菌落总数的影响见表3，2种促进剂对菌落总数的影响顺序为：碳酸钙A＞丙酮酸钠B。最优方案为A1B2，即碳酸钙1.5 mg/L，丙酮酸钠3 g/L。

表3 各促进剂对沙门氏菌菌落总数的影响

2.2 抑制剂单因素实验

2.2.1 牛胆盐单因素实验结果

钱红枚等人的研究表明牛胆盐能抑制某些肠道致病菌、革兰氏阳性菌生长[11]。将单因素实验中牛胆盐的浓度设定为1～5 g/L，其他培养条件不变，改变培养基中牛胆盐浓度对沙门氏菌生长的影响由图3可知，沙门氏菌菌落总数随牛胆盐浓度升高而升高，浓度为3 g/L时达到最高，随后逐渐下降，金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌的菌落总数随牛胆盐的浓度升高而降低。经F检验和LSD两两比较，牛胆盐浓度在3 g/L时三种标准菌株的菌落总数与浓度为4 g/L、5 g/L时的菌落总数均不存在统计学差异（P＞0.05），从经济成本考虑，3 g/L作为正交实验中牛胆盐的中间浓度水平。

图3 牛胆盐浓度对菌落总数的影响

2.2.2 新生霉素单因素实验结果

于瑞莉等人的专利表明新生霉素能抑制部分革兰氏阴性肠杆菌，显著促进沙门氏菌辛酸醋酶的产生[12]。将单因素实验中新生霉素的浓度设定为0.5～10 mg/L，其他培养条件不变，改变培养基中新生霉素浓度对沙门氏菌生长的影响由图4可知，沙门氏菌菌落总数随新生霉素浓度升高而升高，浓度为2 g/L时达到最高，随后逐渐下降，大肠埃希氏菌、产气肠杆菌的菌落总数随新生霉素的浓度升高而降低。经F检验和LSD两两比较，新生霉素浓度在2 mg/L时的菌落总数与浓度为5 mg/L、10 m/L时四种标准菌株的菌落总数均不存在统计学差异（P＞0.05），从经济成本考虑，2 mg/L作为正交实验中新生霉素的中间浓度水平。

图4 新生霉素浓度对菌落总数的影响

2.2.3 脱氧胆酸钠单因素实验结果

庄严等人的研究表明脱氧胆酸钠能抑制革兰氏阳性菌的生长，对沙门氏菌的抑制作用弱[13]。将单因素实验中脱氧胆酸钠的浓度设定为0.5～15 g/L，其他培养条件不变，改变培养基中脱氧胆酸钠浓度对沙门氏菌生长的影响由图5可知，沙门氏菌菌落总数随脱氧胆酸钠浓度升高而升高，浓度为5 g/L时达到最高，随后逐渐下降，金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌的菌落总数随脱氧胆酸钠的浓度升高而降低。经F检验和LSD两两比较，脱氧胆酸钠浓度在5 g/L时的菌落总数与浓度为10 g/L、15 g/L时四种标准菌株的菌落总数均不存在统计学差异（P＞0.05），从经济成本考虑，5 g/L作为正交实验中脱氧胆酸钠的中间浓度水平。

图5 脱氧胆酸钠浓度对菌落总数的影响

2.3 抑制剂的正交实验与分析

各抑制剂对沙门氏菌菌落总数的影响见表4，3种选择剂对菌落总数的影响顺序为：新生霉素D＞脱氧胆酸钠E＞牛胆盐C。最优方案为C2D2E2，即牛胆盐3 g/L，新生霉素2 mg/L，脱氧胆酸钠5 g/L。

表4 各抑制剂对沙门氏菌菌落总数的影响

2.4 显色底物及其剂量的确定与分析

据Manafi等报道，沙门氏菌属能产生特异性较强的辛酯酶，在培养基中添加辛酯显色底物5-嗅-4-氯-3-吲哚-辛酯，使菌落呈现出蓝绿色[14-15]。

图6 显色底物显色效果图

分别于18 h、20 h、24 h观察测试片显色结果，18 h即可显色，培养时间越久显色效果越深。检测时间明显优于国标法检测。

表5 不同浓度显色底物显色效果

由图6和表5可知，5-嗅-4-氯-3-吲哚-辛酯浓度的改变对沙门氏菌显色状况影响极大，当5-嗅-4-氯-3-吲哚-辛酯的浓度不低于0.2 g/L时培养基显色效果极佳，从经济成本考虑，选择5-嗅-4-氯-3-吲哚-辛酯的浓度为0.2 g/L。

2.5 特异性验证结果与分析

特异性验证结果见表6，在被检测的11种细菌中，3株沙门氏菌阳性检出率为100%，其余8种非目标菌均未检出，说明该快检培养基具有较好的选择性和特异性。

表6 特异性验证结果

2.6 食品样品检测结果与分析

对采取的80份乳制品和加标的20份乳制品进行检测，根据国家卫生标准中规定的沙门氏菌最低检出限来判定所取样品是否为阳性。快速检测培养基与BS培养基平板、XLD培养基平板对食品中沙门氏菌阳性结果符合均为19份，阴性结果符合分别为80份、79份，总符合率分别为99%、98%。经配对样本T检验得出，快速检测培养基与国标BS培养基平板的检测结果无统计学差异（t=0.000，P＞0.05），快检培养基测试片与国标XLD培养基平板的检测结果无统计学差异（t=0.000，P＞0.05），说明该快检培养基测试片在乳制品沙门氏菌方面的检测中具有较高的检测效率。

3 结论

本文所选择的沙门氏菌快速检测培养基促进剂为碳酸钙、丙酮酸钠，抑制剂为牛胆盐、新生霉素、脱氧胆酸钠，显色底物为5-嗅-4-氯-3-吲哚-辛酯。所优化的沙门氏菌快速检测培养基的成分为：碳酸钙1.5 mg/L，丙酮酸钠3 g/L，牛胆盐3 g/L，新生霉素2 mg/L，脱氧胆酸钠5 g/L，5-嗅-4-氯-3-吲哚-辛酯0.2 g/L，在36±1℃培养18 h即可使菌落呈现出蓝绿色，且效果稳定。检测实际样品结果与国标法无差异，在检测时间方面具有极大的优势，仅需一步増菌，大大缩短了检测时间，可以满足快速检测的要求，适合一般实验室及现场检测，可以向食品生产厂家进行宣传及推广。