乳酸菌分离及在发酵羊乳中的应用

崔梦君，董蕴，单春会，蔡文超，张振东，郭壮

（1.湖北文理学院食品科学技术学院，湖北襄阳441053；2.石河子大学食品学院，新疆石河子832003）

0 引言

在现代食品加工产业中，乳酸菌是生产发酵乳常用的发酵剂菌种之一，具有调整肠道菌群、预防代谢综合征和增强免疫等诸多作用，在婴幼儿配方奶粉和保健食品中亦有着广泛的应用[1]。通过模拟人的味觉系统，电子舌实现了奶酪[2]、牛奶[3]和酸奶[4]等乳制品滋味品质的数字化评价[5]。通过模拟人的嗅觉系统，电子鼻基于金属氧化物传感器矩阵，实现了食品中典型挥发性风味物质的定量分析[6]，目前在奶粉[7]、羊酸奶[8]和冰激凌[9]等乳制品风味品质评价中有着广泛的应用。本研究对襄阳地区青年人肠道中乳酸菌进行了鉴定，同时采用电子舌和电子鼻技术对部分分离株制备的发酵羊乳品质进行了评价，以期为后续具有良好羊乳发酵特性乳酸菌的筛选提供菌株支持。

1 实验

1.1 试剂及仪器设备

1.1.1 材料

全脂羊乳粉和蔗糖。

生化试剂：MRS培养基，rTaq，DNA聚合酶，溶菌酶，蛋白酶K，10×PCR buffer，引物（27F/1495R），d NTP Mix，2×PCR mix，p MD18-T克隆载体，Axygen PCR清洁试剂盒和Escherichia coli top10。

普通化学试剂：氯化钠、醋酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠、碳酸钙、酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、阳离子溶液、阴离子溶液、参比溶液、乳酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、乙酸、磷酸二氢钾、甲醇、乙腈、异丙醇和磷酸。

1.1.2 设备

DG250厌氧工作站，LRH-150生化培养箱，LXJIIB低速大容量多管离心机，vetiri梯度基因扩增仪，DYY-12电泳仪，ECLIPSE Ci生物显微镜，UVPCDS8000凝胶成像分析系统，SA-402B电子舌，PEN 3电子鼻，LC-20ADXR高效液相色谱仪。

2 方法

从湖北文理学院大一学生中共招募健康志愿者7名，其中男生3名，女生4名，年龄在18～20岁之间，BMI值在18.9～21.2之间，所有志愿者均为襄阳本地人，且近1个月内未服用抗生素亦从未接受过肠道手术。取志愿者晨便用于乳酸菌的分离。

2.1 粪便样品中乳酸菌的分离

取2.0 g粪便样品，加入到含有10 mL无菌PBS缓冲液的离心管中，充分振荡混匀后于4℃转速为400 r/min离心10 min，上清液进行10倍梯度稀释，取梯度稀释后-4，-5，-6三个梯度的菌悬液涂布于含有1.0%碳酸钙的MRS固体培养基中，37℃厌氧（85%N2，5%CO2及10%H2）培养48 h。挑选形态大小菌不相同且具有溶钙圈的单菌落进行编号，反复划线于固体MRS平板上，对菌株进行纯化。将分离纯化得到的乳酸菌菌悬液涂布于洁净的载玻片上进行革兰氏染色和过氧化氢酶实验，将革兰氏阳性而过氧化氢酶实验为阴性的菌株判定为疑似乳酸菌菌株。

2.2 疑似乳酸菌的鉴定

采用CTAB法（cetyltrimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵）提取疑似乳酸菌菌株的基因组DNA[10]，参照文献[11]中的扩增体系和扩增条件进行PCR扩增，将扩增的PCR产物进行纯化、连接、转化和验证，挑取阳性克隆子寄往天一辉远生物科技有限公司进行测序。将测序所得的16SrDNA序列与NCBI（National Center for Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心）网站中的Gen-Bank数据库进行同源性比对，运用MEGA5.0的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育树，以确定分离菌株的分类学地位[12]。

2.3 发酵羊乳的制备

全脂羊乳粉、蔗糖和水按照质量比11.5%、6.5%和82.0%的比例混合均匀，65℃水合30 min后进行两段均质（一段20 MPa，二段4 MPa），95℃（5 min）水浴杀菌，冷却至室温后，按照5×106mL-1复原乳的比例分别接入乳酸菌菌悬液，并置于42℃培养箱中恒温发酵24 h后4℃后熟24 h，备用。

2.4 发酵羊乳滋味品质的评价

取50 g发酵羊乳加入150 mL蒸馏水，转速为10 000 r/min(10 min)离心取上清，用吸管吸除上层脂肪，抽滤备用。参照沈馨的方法进行发酵羊乳酸味、苦味、涩味、鲜味和咸味5基本味指标及后味A（涩味的回味）、后味B（苦味的回味）和丰度（鲜味的回味）3个基本味的回味指标测定[13]。每个样品重复测定4次，取后3次数据取平均值用于数据分析。

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2.5 发酵羊乳中有机酸种类和含量的测定

参照田辉的方法进行样品前处理，并进行适当修改[14]。称取2 g发酵羊乳与50μL的68%硝酸混合后，用浓度为0.01 mol/L磷酸二氢钾流动相定容至10 mL，转速为10 000 r/min离心10 min取上清。上清液121℃高温处理15 min后，转速为10 000 r/min（10 min）离心再次取上清液，过0.22μm滤膜备用。

参照杨成聪的方法进行有机酸测定，并进行适当修改[15]。定量有机酸种类为：乳酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸和乙酸。流动相为浓度0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液；pH值为2.90；检测波长为215 nm；色谱柱为Inertsil C18液相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱温为30℃；流速为0.8 mL/min；进样量为20μL。

2.6 发酵羊乳风味品质的评价

取15 g发酵羊乳于电子鼻样品瓶中，室温平衡30 min，按照杨成聪的方法进行测试并做适当修改[16]。设置参数：洗气时间200 s；自动调零时间5 s；探头插入时间5 s；样品测定时间60 s，每间隔1 s测试一个数值；样品间测试间隔1 min；进样流量120 mL/min；选取49～51 s内各传感器的响应值作为原数数据求平均值后纳入后续分析。

2.7 统计分析

使用主成分分析法（principal component analysis，PCA）和多元方差分析法（multivariate analysis of variance，MANOVA）对乳杆菌和W.confusa（融合魏斯氏菌）制备发酵羊乳的差异性进行分析；使用曼-惠特尼（Mann-Whiney）检验对两类发酵羊乳各滋味、有机酸和风味指标的差异性进行分析。使用Origin 8.6软件绘图，使用SAS9.0软件进行数据分析。

3 结果与分析

3.1 青年人肠道源乳酸菌的分离鉴定

本研究从7名青年志愿者的粪便样品中共分离纯化出21株有溶钙圈的菌株，且所有菌株革兰氏染色均为阳性，过氧化氢酶实验均为阴性，因而可以将其初步鉴定为疑似乳酸菌菌株[7]。分别提取21株菌株DNA，在对16SrDNA基因全长进行扩增的和测序的基础上，将所得序列在GenBank中进行相似性比对，同源性比对结果如表1所示。

由表1可知，21株疑似乳酸菌菌株与模式株参比序列同源性均在99%以上，菌株HBUAS54121、HBUAS54124、HBUAS54128、HBUAS54161、HBUAS54169和HBUAS54202被鉴定为Weissella confusa（融合魏斯氏 菌），菌 株 HBUAS54177、HBUAS54179和HBUAS54187被鉴定为Lactobacillus fermentum（发酵乳杆菌），菌株HBUAS54118和HBUAS54181被鉴定为Lactobacillus ruminis（瘤胃乳酸杆菌），菌株HBUAS54176、HBUAS54178和HBUAS54199被鉴定为Lactobacillus plantarum（植物乳杆菌），菌株HBUAS54183和HBUAS54186被鉴定为Lactobacillusreuteri（罗伊氏乳杆菌），菌株HBUAS54184和HBUAS54185被鉴定为Lactobacillus johnsonii（约氏乳杆菌），菌株HBUAS54111、HBUAS54131和HBUAS54145分别被鉴定为Lactobacillus agilis（敏捷乳杆菌）、Lactobacillus delbrueckii subsp.Delbrueckii（德氏乳杆菌德氏亚种）和Lactococcus garvieae（格氏乳球菌）。分离株与模式菌株的系统发育树如图1。

表1 菌株16SrDNA序列同源性比对结果

图1 乳酸菌16SrDNA序列系统发育树

由图1可以看出，菌株HBUAS54118和HBUAS54181与模式菌株L.ruminis NBRC102161位于系统发育树的同一个分支上；菌株HBUAS54176、HBUAS54178和HBUAS54199与模式菌株L.plantarum NBRC15891位于系统发育树的同一个分支上；菌株HBUAS54184和HBUAS54185与模式菌株L.johnsonii ATCC33200位于系统发育树的同一个分支上；菌株HBUAS54183和HBUAS54186与模式菌株L.reuteri DSM 20016位于系统发育树的同一个分支上；菌株HBUAS54177、HBUAS54179和HBUAS54187与模式菌株L.fermentum CIP102980位于系统发育树的同一个分支上；菌株HBUAS54121、HBUAS54124、HBUAS54128、HBUAS54161、HBUAS54169和HBUAS54202与模式菌株W.confuse JCM 1093位于系统发育树的同一个分支上；菌 株 HBUAS54111、HBUAS54131和HBUAS54145分别与模式株 L.agilis DSM 20509、L.delbrueckii subsp.Delbrueckii BCRC12195和L.garvieae NIZO2415位于系统发育树的同一个分支上。本研究分离的21株乳酸菌共鉴定为2个属和9个种，且W.confusa共有6株，占分离株的28.57%。由此可见，襄阳地区青年人肠道中乳酸菌类群多样性较高，且以W.confusa为主。

3.2 青年人肠道源乳酸菌发酵羊乳滋味品质的评价

在对青年人肠道中乳酸菌菌株进行分离鉴定的基础上，本研究选取可用于食品加工的部分L.fermentum、L.plantarum、L.reuteri和L.johnsonii菌株进行了发酵羊乳制备，同时以W.confusa为对照，对青年人肠道源乳酸菌发酵羊乳的滋味品质进行了评价，其各滋味指标相对强度的箱型图如图2所示。

图2 发酵羊乳各滋味指标相对强度的箱型

3.3 青年人肠道源乳酸菌发酵羊乳风味品质的评价

本研究进一步采用电子鼻对发酵羊乳风味品质进行了检测与评价，各传感器响应值的差异性分析如表3所示。

由表3可知，传感器W1C和W 3C对乳杆菌发酵羊乳的响应值显著高于W.confusa（P＜0.05）。由表2亦可知，传感器W1C和W3C主要对芳香类物质灵敏，因而乳杆菌发酵羊乳的风味品质优于W.confusa。值得一提的是，传感器W 1S，W 2S，W3S，W5S，W6S，W1W，W 2W和W 5C对两类乳酸菌发酵羊乳的响应值差异均不显著（P＞0.05）。

3.4 乳酸菌发酵羊乳产品品质评价

本研究基于多元统计学方法对青年人肠道源乳酸菌发酵羊乳产品品质评价：进一步结合电子舌和电子鼻数据使用PCA（主成分分析法）对其进行了评价和分析，经PCA发现，前4个主成分的累积方差贡献率为88.42%，且前6个主成分的特征值均大于1。根据主成分个数确定的原则，若某一主成分的累计方差贡献率大于85.0%且其特征值大于1.0，则将其定义为主成分[17]，因而本研究选取了4个主成分，其中第一主成 分（Principal Component1，PC1）的 贡 献 率 为52.94%，PC2的贡献率为15.63%，PC3的贡献率为12.24%，PC4的贡献率为7.61%。基于PCA发酵羊乳主成分分析的因子得分如图3所示。

由图3可以看出，PC1主要由风味指标构成，包括W1C，W3C，W5C，W1S，W2S，W5S，W6S，W1W和W2W；而PC2主要由滋味指标构成，包括酸味、鲜味、丰度（鲜味的回味）和后味A（涩味的回味）。基于PCA发酵羊乳滋味品质的PC1与PC2因子载荷图如图4所示。

由图4可以看出，乳杆菌和W.confusa制备的发酵羊乳样品在空间排布上呈现出明显的分离趋势，这说明两类发酵羊乳的品质存在较大的差异，且经MANOVA发现差异显著（P＜0.05）。由图5可以看出，由L.fermentum HBUAS54187，L.plantarum HBUAS54176和L.johnsonii HBUAS54185制备的发酵羊乳均分布在第三象限；电子鼻传感器W 1C，W 3C和W 5C对其响应值明显偏高且酸味浓郁，具有良好的滋味和风味品质。由此可见，上述3株乳杆菌可作为潜在菌株，用于后续具有良好羊乳发酵特性乳酸菌的筛选。

表3 各传感器对发酵羊乳响应值差异分析

图3 发酵羊乳滋味品质PC1与PC2因子载荷图

图4 发酵羊乳滋味品质PC1与PC2因子得分图

4 结论

本文对襄阳地区青年人肠道中乳酸菌分离及在发酵羊乳中的应用进行了研究。结果表明：从粪便样品中共分离出21株疑似乳酸菌菌株，共鉴定为2个属和9个种，且W.confusa占分离株的28.57%。通过电子舌分析发现，由乳杆菌和W.confusa制备的发酵羊乳各滋味指标差异不显著（P＞0.05）。通过电子鼻分析发现，传感器W 1C和W3C对乳杆菌发酵羊乳的响应值显著高于W.confusa（P＜0.05）。通过主成分分析和多元方差分析发现，乳杆菌和W.confusa制备的发酵羊乳品质存在显著的差异（P＜0.05）。由此可见，W.confusa为襄阳地区青年人肠道中的优势乳酸菌，较之W.confusa乳杆菌制备的发酵羊乳具有更佳的品质。