低温储存条件对原料乳嗜冷菌及细菌多样性的影响

2019-09-10雷鸣胡楠王远一飞张燕

中国乳品工业 2019年7期

雷鸣，胡楠，王远一飞，张燕

(1.天津科技大学食品工程与生物技术学院食品营养与安全国家重点实验室，天津300457;2.南开大学医学院天津市食品科学与健康重点实验室，天津300071）

0 引言

鲜牛乳是理想的微生物生长基质[1]，过高的储存温度，会导致其变质。因此在其储运环节中，低温成为必要条件。低温能够抑制牛乳中大部分微生物的活性，但其中的嗜冷菌仍能在低温环境中繁殖[2]。热灭菌法可有效杀灭嗜冷菌，但其分泌的蛋白酶和脂肪酶具有耐热性，可导致原料乳在热灭菌后产生凝胶，沉淀，变苦[3]，并造成发酵产品品质缺陷[4]。目前我国食品安全国家标准中未规定生乳中嗜冷菌限量，因此分析低温下嗜冷菌的变化规律对于提高牛乳品质具有重要意义。

本研究通过16S rRNA高通量测序及国标方法，监测原料乳在不同温度储存下嗜冷菌数及菌落总数的变化，旨在探究在不同温度储存期间牛乳卫生指标的变化情况以及保证原料乳高品质的冷藏温度及时间。

1 实验

材料为原料乳。

1.1 样品测序

取在4℃储存一天的原料乳两份，每份样品25 g，过0.22μm无菌滤膜，将原料乳中的微生物富集于膜上，然后将无菌滤膜放入无菌采样袋于-80℃保存备用。

1.1.1 基因组DNA的提取和PCR扩增

采用SDS方法对样本的基因组DNA进行提取，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1 ng/μL。

以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物，New England Biolabs公司的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。引物对应区域为16SV4区引物（515F和806R）。

1.1.2 PCR产物的混样和纯化

PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测：根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用胶回收试剂盒回收目的条带。

1.1.3 文库构建和上机测序

使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用HiSeq2500 PE250进行上机测序。

1.2 测序数据分析

1.2.1 测序数据处理

根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样品数据，截去Barcode和引物列后应用文献[5]中方法对每个样品的序列进行拼接，得到原始数据；再经过严格的过滤处理[6]得到高质量数据。

参照文献[7]中的质量控制流程，进行数据截取和长度过滤操作，经过以上处理后得到的数据还需要通过文献[8]中方法与数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列[9]，得到最终的有效数据。

1.2.2 OTU聚类和物种注释

利用Uparse软件[10]对所有样品的全部有效数据以97%的一致性进行聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units），同时选取OTUs的代表性序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA[11]的SSUrRNA数据库[12]进行物种注释分析（设定阈值为0.8～1），获得分类学信息并统计各样本的群落组成。使用MUSCLE[13]软件进行快速多序列比对，得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。最后以样品中数据量最少的为标准进行均一化处理，后续的Alpha多样性分析都是基于均一化处理后的数据。

1.3 菌落总数测定

食品微生物学检验：乳与乳制品检验GB 4789.18-2010[14]。

1.4 嗜冷菌测定

乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定NY/T 1331-2007[15]。

1.5 原料乳储存条件

取新鲜原乳，分别在4，10，15℃下储存并在不同规定时间取样，测定总菌数、酸度及嗜冷菌菌数并记录其变化。不同储存温度下的监测总时间及检测频率如表1所示。

表1 原料乳不同储存温度检测频率及检测时间

2 结果与讨论

2.1 原料乳中的细菌多样性

将原料乳中提取的微生物核酸序列进行测序聚类，得到样品聚类信息，结果如图1所示。

图1 样品OTUs聚类韦恩图

图1 中，M 1和M 2分别代表测序样品；65为两个样品共有的聚类单元数；12为M 1样本的特有聚类单元数；7为M 2样本的特有聚类单元数。两个样本共检测到聚类单元（OTUs）84个，其中M 1样品中检测出77个聚类单元，M 2样品中测得72个聚类单元。两个样品共有的聚类单元65个，超过聚类单元的70%，说明两份原料乳样品中检出的微生物物种数量虽然有所不同，但大部分微生物相同。

一些微生物能够在低温储存一天后成为原料乳中的优势菌种，在低温环境中能够保持一定繁殖和代谢能力，是影响原料乳品质的关键微生物。通过聚类单元的物种注释信息及各个物种的相对丰度信息，可以直观找到原料乳样品中的优势微生物。根据样品中相对丰度前十的物种相对丰度信息绘制的物种分类树如图2所示。图2中，左侧为图例，红色扇形代表样品M 1，蓝色代表样品M 2；扇形面积大小表示样品在该分类上相对丰度的比例大小；分类名下方的两个数字分别表示所有样品在该分类上的平均相对丰度，前者表示占所有检出序列的相对丰度，后者表示占样品中细菌的相对丰度。

图2 TOP10物种分类树

分析可知，原料乳中的原核微生物主要分属三个门，拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度占比超过90%，其中拟杆菌门所占比例最高，拟杆菌门中主要有两个属在原料乳样品中相对丰度较高，分别为金黄杆菌属和黄杆菌属。样品中变形菌门主要包括醋酸杆菌科的醋酸杆菌属，肠杆菌科的摩根氏菌属，莫拉菌科的不动杆菌属和嗜冷杆菌属以及假单胞菌科的假单胞菌属。除此之外，样品中还检出了少量厚壁菌门的微生物，主要包括乳球菌属和葡萄球菌属。

在相对丰度前十的物种中，含量最为丰富的是黄杆菌属，其相对丰度占所有检出的细菌的47.66%，其次为假单胞菌属，相对丰度为39.54%。两个属的微生物均为牛乳中常见的嗜冷菌[16]。不动杆菌属和嗜冷杆菌属也具有在低温下继续生长的能力，相对丰度分别为3.77%和0.55%。

通过对16SrRNA高通量测序结果分析可知，此次采集的原料乳中，嗜冷菌主要来自四个属，分别为黄杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属和嗜冷杆菌属。假单胞菌属是对原料乳危害最大的嗜冷菌之一[17]。假单胞菌及其分泌的耐热蛋白酶也被当作嗜冷菌耐热蛋白酶的模板，许多研究者对其进行了深入研究[18-20]。不动杆菌属和黄杆菌属除了能够在低温环境中继续生长繁殖，其潜在致病性和耐药性也受到广泛关注[21-24]，对牛乳的影响不仅仅是对成品乳质量的威胁，低温环境下不动杆菌及黄杆菌在牛乳中的相对含量逐渐上升，若在加工设备中其毒素和分泌物不断累积，除了可能对原料乳品质产生不良影响，还可能引发食品安全问题。

2.2 不同储存条件下原料乳中嗜冷菌及菌落总数的变化

原料乳从收集入厂到生产期间要求冷却到4℃贮存，但冷链运输及工厂储存条件的变化会使原料乳很难严格维持在4℃，而原料乳低温储存过程中微生物变化情况将直接影响最终产品的质量，因此储存环节是牛乳品质控制的关键。实验模拟可能的温度变化分别设置了4，10，15℃贮存原料乳；定时测定嗜冷菌及菌落总数。

原料乳在不同温度储存期间菌落总数变化如图3所示。图3（a）为4℃和10℃储存时原料乳菌落总数变化；图3（b）为15℃储存时原料乳菌落总数变化。

原料乳中总菌落数在（1.5～1.8）×105mL-1之间，反映出原料乳卫生状况较好。分析发现，菌落总数的变化随贮存温度、贮存时间的变化有显著差异。4℃贮存72 h后菌落总数仍在1×106mL-1内；10℃贮存64 h后样品中菌落总数快速增加，贮存72 h后超过国家安全标准2×106mL-1；15℃贮存24 h后菌落总数快速增加，超过国家规定的安全限量。

我国“生乳食品安全标准”中并没有对嗜冷菌进行限量，但原料乳低温储存时嗜冷菌能分泌蛋白酶、脂肪酶等引起牛乳品质劣变。因此嗜冷菌是影响液态奶品质的重要因素。原料乳在不同温度储存期间的嗜冷菌数变化情况如图4所示。

图3 原料乳菌落总数变化

图4 不同温度储存期间的嗜冷菌数变化情况

原料乳中嗜冷菌含量在1～1.3×105mL-1。不同贮存温度下，嗜冷菌数变化差别较大。4℃贮存24 h，嗜冷菌数无明显变化，贮存至32 h嗜冷菌数显著增加，但后期贮存至72 h并没有检测到数量显著增加；10℃贮存时，24 h时嗜冷菌数已增至1×106mL-1，72 h后超过国家规定的原乳中菌落总数限量值2×106mL-1；15℃贮存8 h时，嗜冷菌数已显著增加，24 h后嗜冷菌数超过2×106mL-1。

以上结果说明，低温储藏过程中嗜冷菌依然可以存活并增殖，4-15℃贮存条件下，随温度的升高嗜冷菌的生长繁殖速度迅速增大。虽然在低温下原料乳中微生物数量增长缓慢，但其多样性能够迅速发生变化[25-27]。冷藏前，嗜冷菌仅占原料乳微生物总量的10%左右[28]，16SrRNA高通量测序结果表明4℃冷藏一天后，原料乳中的嗜冷菌相对含量超过了90%，嗜冷菌成为了原料乳中的优势菌。尽管15℃贮存24 h后菌落总数才超过生乳安全限量标准（2×106CFU/mL），但低温贮存过程中伴随嗜冷菌的繁殖生长，嗜冷菌分泌蛋白酶、脂肪酶等的风险增大，极易引起牛乳品质劣变。因此实际运输和贮存期间应严格控制温度，应尽可能以更低的温度贮存生乳，以保证生乳的安全卫生，提高乳制品品质。

现行国标中虽然规定了嗜冷菌的计数方法，但其方法培养时间过长，无法满足企业生产需要。经研究发现，低温储存时，原料乳中的嗜冷菌数量和菌落总数能够呈现一定的线性关系，且储存温度越低，菌落总数和嗜冷菌数的相关系数越大[29]。我们的高通量测序结果也发现，4℃贮存24 h的牛乳中嗜冷菌数占总菌的90%，因此实际生产过程中可通过构建菌落总数与嗜冷菌数的线性模型来快速推算原料乳中嗜冷菌的数量。