降胆固醇乳酸菌的益生特性及其作用机理

付永岩，赵悦含，王毅超，高达，孙长豹，姜瞻梅，刘飞，侯俊财

（东北农业大学乳品科学教育部重点试验室，哈尔滨150030）

0 引言

近年来，因高胆固醇引起的动脉粥样硬化及心脑血管等病发症逐年升高，全球人类的健康受到了严重影响[1－2]。一些专家致力于益生菌的研究，包括其降胆固醇的益生作用逐渐被发掘，引发国内外广泛关注[3]。在食品加工过程中，高效降胆固醇菌种具有重要的应用价值，通过添加益生菌的保健食品来控制人体内胆固醇含量，促进和防治心脑血管的健康及疾病，极有可能成为保健食品下一个高速发展的领域[4－5]。

本研究旨在通过引入共沉淀、体外去除胆固醇量等方法，初探乳酸菌降胆固醇作用机理，在通过模拟胃液胰液实验测试菌株的耐受性以及抗生素抗性和疏水性指标来评价降胆固醇菌株的潜在益生特性，使之能更加有效的降低心脑血管等疾病的发病率，为以后的食品、医疗事业提供依据。

1 实验

1.1 材料

胆固醇，正乙烷和95%乙醇，邻苯二甲醛，牛胆盐。植物乳杆菌117-1和23-1，鼠李糖乳杆菌118-1，粪肠球菌M 53-2，乳酸乳球菌L14-3五种菌株均由东北农业大学乳品科学教育部重点实验室乳酸菌菌种库提供。

1.1.1 仪器

洁净工作台VD-1320，电热恒温培养箱DHP-9272，DK-8D型电热恒温水槽，全自动高压灭菌锅HVE-50，低温冷冻离心机，离心机GL-21M，DELTA320型pH计。

1.1.2 培养基

（1）MRS液体培养基成分如表1所示。

表1 MRS液体培养基

（2）配制MRS固体培养基：在液体培养基的基础上加入1.8%（w/v）的琼脂。

（3）配制MRS-Oxgall-CHOL液体培养基：在液体培养基的基础上加入（体积分数0.2%）疏基乙醇酸钠，过滤除菌的100μg/mL胆固醇和3 g/L牛胆盐。

1.2 方法

1.2.1 胆固醇含量的测定

采用邻苯二甲醛法[6]：取1 mL样品、6 mL 95%乙醇和4 mL质量浓度500 g/L氢氧化钾放入试管中，旋涡振荡混匀。60°C恒温水浴锅中加热10 min，添入10 mL正己烷，萃取20 s，添加4 mL蒸馏水，静置15 min。吸取8 mL正己烷层，水浴氮气（60°C）吹干。添加4 mL质量浓度0.5 mg/mL的邻苯二甲醛溶液（已用冰醋酸定容），静置10 min。向每个试管内部吸移2 mL浓硫酸，旋涡震荡20 s，静置显色反应10 min。检测OD550nm，空白对照为未接菌的培养液，重复3次。

胆固醇标准曲线的制作：无水乙醇把0.1 g胆固醇粉末定容成质量浓度1 mg/mL的溶液。配制成质量浓度为5，10，15，20，25和30μg/mL的胆固醇溶液，参照上述方法，检测OD550nm，并以吸光度值为纵轴，以胆固醇质量浓度为横轴[7]。

1.2.2 降胆固醇能力的测定

菌株活化两代后，在MRS-Oxgall-CHOL液体培养基中接入体积分数为3%的接种量，厌氧37℃下，24 h后置于离心机（转速12 000 r/min，10 min），空白对照选用未接种菌株培养液。参照1.2.1的方法，按胆固醇标准曲线计算胆固醇去除量，其计算公式为

式中：B和S分别为未接种菌株和接种菌株培养液离心上清液的胆固醇质量浓度，μg/mL。

1.2.3 降胆固醇菌株潜在的益生特性

1.2.3.1 酸耐受性和胆盐耐受性

制备人工胃液：用灭菌后的PBS将（1∶10000）胃蛋白酶配制成3 mg/mL的溶液，在用1 mol/L盐酸调至成pH值为2.0和3.0，经0.22μm微孔滤膜过滤备用[8]。制备人工胰液：用灭菌后的PBS将（1∶250）胰蛋白酶配制成质量浓度为1 mg/mL溶液，在用浓度为1 mol/L氢氧化钠调至成pH值为7.0，经0.22μm微孔滤膜过滤备用。

模拟人工胃液耐受性实验：菌株活化两代后，以体积分数为2%接种量接于MRS液体培养基中，培养18 h。并于转速为8 000 r/min下离心10 min，用PBS洗涤2次。将菌体重新悬浮于5 mL的的人工胃液中。在p H值为2.0人工胃液中孵育0，0.5 h和p H值为3.0下孵育0，1 h和3 h后，采用平板涂布法计算活菌数量，重复3次实验。

模拟人工胰液耐受性试验：前期处理参照模拟胃液耐受性实验，并重新悬浮于5 mL的人工胰液中，采用平板涂布法计算培养0，1，2，3 h的活菌数量，重复3次实验[9]。

存活率=处理后活菌数/未处理活菌数×100%。

1.2.3.2 抗药性

菌种活化两代，在15 mL的MRS琼脂培养基中，添加15 mL含有10%新鲜适宜浓度菌液的软琼脂（0.8%的琼脂）。在无菌条件下，将药敏检测纸片轻贴与冷却后的培养基中，培养24 h后观察并测量抑菌圈直径大小，质控菌：金黄色葡萄球菌ATCC 25923。方法与供试菌株相同，参照美国临床和试验室标准化协会公布的药敏试纸标准[10]，重复3次实验。

表2 药敏纸片含药量及抗性判断标准

1.2.3 降胆固醇的作用机理

菌株活化2次后，在MRS液体培养基中添加质量浓度为2 g/L的牛胆盐，121℃下灭菌15 min，加入除菌的100μg/mL胆固醇。

以体积分数为2%接种量分别加入添加和未添加胆盐的MRS-CHOL液体培养基中，37℃下培养48 h，并在转速为5 000 r/min下，离心10 min，参照1.2.1的方法，测定胆固醇浓度（标记为A、B）。用5 mL p H值为7.0浓度为0.1 mol/L的PBS重悬未添加胆盐培养基中的菌泥（不添加胆盐的MRS-CHOL培养基培养的菌泥），取各10μL浓度为50 mg/L的溶菌酶和质量分数为10%的SDS添加到1 mL菌悬液中，37℃水浴1 h，超声破碎后置于离心机中（转速8 000 r/min，10 min）离心，测定上清液胆固醇含量（D）。将剩余菌悬液再次离心（5 000 r/min，4℃），并测定上清液胆固醇质量浓度（C），在转速为8 000 r/min，4℃下，用1 mL的PBS洗涤破壁处理后的剩余菌泥2次，离心10 min后弃上清，用1mL无水乙醇重悬菌泥，在5 000 r/min，10 min离心后，测定1 mL上清液胆固醇质量浓度（E）[11－12]。重复3次实验，胆固醇去除量的计算公式为

式中：F为胆酸盐与胆固醇共沉淀量；G为菌体吸收去除胆固醇量；H为不接种的添加胆盐的MRS-CHOL培养基中胆固醇质量浓度；I为细胞膜的结合量。

1.2.4 数据统计与分析

采用Excel2016软件分析数据，每个实验重复3次；采用SPASS19.0软件进行差异显著性分析，结果表示为平均值±标准差。

2 结果分析

2.1 胆固醇标准曲线的绘制

胆固醇标准曲线如图1所示，胆固醇的浓度与OD值的关系为y=0.0297x＋0.0377，线性相关系数R2=0.993，线性相关良好。

图1 胆固醇标准曲线

2.2 乳酸菌株的降胆固醇测定

通过菌体在含胆固醇的培养基中培养前后的胆固醇含量变化的差值评价菌株的降胆固醇能力。依据图1所绘胆固醇标准曲线，按照1.2.1的方法进行降胆固醇作用体外筛选，菌株名称均采用原始编号。由表3可知，5株菌体外胆固醇去除率均在25%以上，对培养基中胆固醇的去除能力表现出了明显的差异（P＜0.05），乳酸乳球菌L14-3的胆固醇去除能力最强，为35.90%。

表3 乳酸菌对胆固醇的去除能力

2.3 降胆固醇菌株潜在的益生特性

2.3.1 酸耐受性

5株降胆固醇菌株对人工胃液的耐受性如图2所示。

图2 人工胃液的耐受性

受试菌在p H值为2.0的人工胃液中孵育1 h后，无活菌检出。由图2（a）可知，孵育0.5 h后，植物乳杆菌117-1，23-1和鼠李糖乳杆菌118-1活菌数都下降到103mL-1水平以下，说明这3株菌在p H值为2.0的环境下耐受性不好，存活率显著降低。粪肠球菌M 53-2和乳酸乳球菌L14-3的活菌数显著高于其他3株菌（P＜0.05）。

由图2（b）可知，在pH值为3.0条件下孵育1 h后，5株菌株的活菌数并未显著减少，鼠李糖乳杆菌118-1和植物乳杆菌23-1存活率显著高于其他菌株（P＜0.05），说明这两株菌在pH值为3.0和1 h时有较好的耐受性。3 h后，5株菌的存活率均存在显著差异（P＜0.05）。粪肠球菌M 53-2的存活率显著高于其他4株菌，这说明菌株M 53-2对p H值为3.0的模拟胃液有较好的耐受性，其次是乳酸乳球菌L14-3和鼠李糖乳杆菌118-1。植物乳杆菌23-1和117-1的存活率相对较低。图2中，数据角标不同即差异显著（P＜0.05）。下同。

2.3.2 胆盐耐受性

5株降胆固醇菌株对人工胰液的耐受性见图3。5株菌在人工胰液中的存活率较高，孵育1 h后活菌数较0 h时无明显差异。但在孵育2～3 h后，菌株存活率有所下降。孵育2 h后菌株的存活率存在显著差异（P＜0.05），粪肠球菌M 53-2和乳酸乳球菌L14-3的存活率相对较低；在孵育3 h后，存活率最高的是鼠李糖乳杆菌118-1；存活率最低的是粪肠球菌M 53-2，活菌数降至2.07×107mL-1。综上所述，鼠李糖乳杆菌118-1和植物乳杆菌117-1对人工胰液的耐受性更好，并且存活率显著高于其他菌株（P＜0.05）。

图3 对人工胰液的耐受性

2.3.3 抗药性

5株菌株对6种抗生素的抗药性实验，结果如表4所示。表4中，5株供试菌株都至少对一种抗生素具有抗性，植物乳杆菌117-1对4种抗生素表现为抗性，鼠李糖乳杆菌118-1、粪肠球菌M 53-2和植物乳杆菌23-1对3种抗生素表现为抗性，乳酸乳球菌L14-3仅对链霉素表现为抗性。

表4 抑菌圈直径及抗性结果

2.4 菌体吸收和共沉淀作用

表5所示为5株菌株体外胆固醇去除率，以胆固醇、胆盐的共沉淀作用和菌体细胞吸收为去除体外胆固醇的主要形式。在培养过程中5株菌株均会产酸。酸性条件下部分胆固醇与胆盐行成沉淀，另一部分通过菌体吸收作用而除去，少部分依靠细胞膜的结合作用。鼠李糖乳杆菌118-1通过菌体吸收作用去除的胆固醇量占总去除率的比例最高，为31.81%，其次是植物乳杆菌117-1和23-1，分别为27.91%、26.59%，粪肠球菌M 53-2和乳酸乳球菌L14-3最低，分别为20.66%和16.33%；乳酸乳球菌L14-3通过共沉淀作用去除的胆固醇量占总去除率的比例最高，为81.23%，其次是菌株M 53-2和23-1，分别为74.03%和71.28%，菌株117-1和118-1最低，分别为66.36%和63.69%。

表5 菌株体外胆固醇去除率的分布 %

3 结果与分析

现如今国内外降胆固醇的作用机理尚未清晰，Rossi等人[13]认为胆固醇通过掺入细胞膜方式，从而改变细胞膜的韧性；Gilliland[6]认为是依靠于乳酸菌菌体的吸收作用；其他研究表明降胆固醇与菌体的胆盐水解酶活力有关[14]。本研究中菌株通过胆固醇、胆盐的共沉淀作用和菌体细胞吸收作用去除胆固醇所占比例大，与李昵[15]的研究结果相似。菌株118-1菌体吸收作用去除的胆固醇量占总去除率的比例最高，为31.81%，菌株117-1和菌株23-1分别为27.91%和26.59%，菌株M 53-2和菌株L14-3最低，分别为20.66%和16.33%。说明该5株菌具有在人体内降低血清胆固醇的潜力。

空腹时人体胃液的pH范围在1.3～1.8，随着食物或乳制品的摄入升高至3.0或更高，在pH值为3下存活1.5～2 h被认为是益生菌低p H值耐受性的一个标准。在p H值为2.0人工胃液的条件下孵育1 h后，5种菌株均无存活，说明抗性较差。食物在人体胃内的停留时间大约2 h，孵育2 h后，5种菌株的活菌数均在107mL-1水平及以上，其中植物乳杆菌23-1和鼠李糖乳杆菌118-1的活菌数在108mL-1水平，较初始活菌数相差不多，说明植物乳杆菌23-1和鼠李糖乳杆菌118-1耐酸性较好；在pH值为3.0条件下孵育3 h，5种菌株菌落数均在104mL-1水平及以上，其中粪肠球菌M 53-2和乳酸乳球菌L14-3的活菌数在106mL-1水平。说明在p H值为3.0条件下5株菌株耐受性良好。

益生菌对肠液的耐受性更为重要，只有在肠液中定植才能发挥更好的益生作用，人体的小肠属中性环境，故选用人工胰液pH值为8.0测定菌株对胰液的耐受性。Begley等[16]人指出：不同乳酸菌对胆汁的耐受程度不同，Usman[17]和Liong等[18]人也相继发现，不同乳酸菌对质量分数为0.3%牛胆盐的耐受性不同，各菌株之间的耐受性有所差异。在模拟胰液的耐受性试验中，在p H值为8.0人工胰液条件下孵育3 h，鼠李糖乳杆菌118-1和植物乳杆菌117-1的活菌数均能维持在108mL-1左右，说明这两株菌对胰液具有较好的耐受性，而其他3株菌的活菌数均在107mL-1水平，对胰液的耐受性相对较弱。说明菌株在模拟人工胃肠道环境中存活性较好。

本研究结果表明，只有植物乳杆菌117-1对万古霉素具有抗性。D'Aimmo等[19]研究表明，受试乳酸菌对庆大霉素表现为抗性，对红霉素敏感，但是对链霉素、四环素的抗药性差异较大。Zhou，N等[20]研究表明，从酸奶中分离的35株乳酸菌对链霉素、庆大霉素的抗药率高于80%；秦宇轩等[21]研究表明所有供试乳酸菌均对庆大霉素和链霉素具有抗性，部分菌株对万古霉素表现为抗性，对红霉素和四环素表现为敏感或中度敏感。以上的研究结果与本研究基本一致，在5株菌株中植物乳杆菌117-1的抗药性最好。

4 结论

本试验结果表明，尽管降胆固醇机制有很多理论，但绝大多数是在体外以共沉淀和菌体吸收的形式来降低胆固醇，其作用机理仍需不断深入研究。在降胆固醇乳酸菌的潜在益生性的研究中，5株菌株表现出能更加有效地降低高胆固醇引发的病发率潜在前景，综合评价5株菌在模拟胃液、胰液中的存活率，表面疏水性及抗生素抗性的耐受情况，植物乳杆菌117-1和鼠李糖乳杆菌118-1抗逆性较强，可以为以后的食品、医疗等事业提供相应理论依据。