缝隙连接蛋白及其阻断剂研究进展

王光亮，吴雪梅

(1.东北国际医院第一医院心内科，辽宁 沈阳 110000；2.吉林大学第一医院小儿神经科，吉林 长春 130000)

缝隙连接是细胞间最常见的连接方式，其参与调控细胞的生长、分化、增殖过程[1]。缝隙连接是位于相邻细胞膜上的跨膜通道，允许相对分子质量小于1 000或直径小于1.5 nm的分子如环单磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、Ca2+三磷酸肌醇(inositol 1，4，5-trisphosphate,IP3)、三磷腺苷(adenosine triphosphate,ATP)以及一些小分子通过[2]。缝隙连接是细胞间电活动传递的主要物质基础。心肌细胞间缝隙连接的主要功能是在细胞间起代谢耦联与电偶联作用，是维持心肌细胞电生理活动的基础，与多种心脏疾病密切相关[1-2]。神经元缝隙连接通路在癫痫、缺血性脑血管病、脑损伤等神经系统疾病中也扮演着重要角色[3-5]。缝隙连接的通透功能可塑性较高，缝隙连接半通道的开闭可以被多种因素调控。缝隙连接开放可以促进细胞间电活动，从而引起相关疾病，应用缝隙连接阻断剂减少缝隙连接的开放可能减轻细胞间电活动，缝隙连接阻断剂可能成为心血管及神经系统疾病治疗的研究热点，为新型药物的研发提供思路[6-7]。本文就心肌细胞及神经细胞缝隙连接蛋白的典型代表Cx36、Cx43及其阻断剂的研究进展进行综述。

1 缝隙连接蛋白的种类、主要功能及调节因素

1.1 缝隙连接蛋白的种类缝隙连接是由缝隙连接蛋白构成，缝隙连接蛋白一般均成簇分布,数目为6～1 000个，甚至更多。缝隙连接由相邻细胞膜上镜像对称的半通道组成。该半通道是由6个缝隙连接蛋白组成，为中空六聚体结构[8]。缝隙连接蛋白是多基因家族编码的一大类膜蛋白。缝隙连接蛋白的种类包括Cx26、Cx30、Cx31、Cx32、Cx33、Cx37、Cx40、Cx43、Cx45、Cx46、Cx50、Cx57等[8-9]。根据缝隙连接蛋白基因相对分子质量大小，一般将缝隙连接蛋白分为3大类[2]：Ⅰ组(即β类)的缝隙连接蛋白包括Cx26、Cx30、Cx31、Cx32；Ⅱ组(即α2类)的缝隙连接蛋白包括Cx33、Cx37、Cx40、Cx43、Cx45、Cx46、Cx50、Cx57；Ⅲ 组(即γ2类)的缝隙连接蛋白主要以新近发现的Cx36为代表[10]。

在心室肌细胞主要表达的是Cx43，在神经元细胞主要表达的是Cx36[5]。心肌细胞缝隙连接主要由Cx40、Cx45和Cx43构成，心室肌的缝隙连接则主要由Cx43构成。缝隙连接蛋白Cx43的数量、分布、磷酸化水平等出现异常将导致心室肌细胞的整体性异常，使细胞间电信号传导速度和方向发生异常改变，心肌产生折返和传导阻滞，进而发生心律失常。Cx36相对分子质量约36 000，被命名为Cx36[10]。在中枢神经系统中，Cx36主要表达于神经元上，在星形胶质细胞及少突胶质细胞几乎无表达，Cx36在脑的下橄榄核最密集，于海马的CA1、CA3、CA4等区高度表达。Cx36构成的缝隙连接是神经元之间最常见的耦联形式，是神经元之间电偶联的结构基础。Cx36在中枢神经系统内广泛多样化表达，提示其可能在电信号的传递方面发挥着非常重要的作用[5,10]，由其参与构成的缝隙连接对中枢神经元动作电位的发放模式和动作电位发放的同步化起着重要作用。众多实验研究报道，其参与癫痫的发作过程[11-12]。

1.2 缝隙连接蛋白的功能缝隙连接通过细胞间的直接信号传导统一协调细胞的发育、形态、增殖、分化，缝隙连接蛋白功能、结构及数量改变可以引起多种疾病发生。

缝隙连接蛋白Cx43是心室肌细胞间隙连接通道，主要功能是在细胞间起代谢耦联与电偶联作用，是维持心肌细胞电生理活动的基础，与心房颤动、风湿性心瓣膜病等多种心脏疾病密切相关[3-4]。心室肌细胞的Cx43主要集中在闰盘处，其传导电化学信号可以沿纵向和横向双向传导。细胞间相邻部位的闰盘的一侧Cx43数量明显多于另一侧相邻部位，这使得电传导方向主要沿细胞纵轴传播，并且沿纵轴的电信号传导速度要远快于沿横轴方向。若Cx43的正常排列遭到破坏，可导致心肌电信号传导的不连续性和不均匀性增加，进而导致心律失常。

神经元的主要缝隙连接蛋白Cx36的功能有[13]：(1) 介导神经元之间的电传递。缝隙连接被称为神经元的电突触，神经细胞之间动作电位的传递时间间隔几乎为零；因此，认为这种传递是直接通过缝隙连接，而不是通过化学突触。缝隙连接的直接传递也被认为是使神经元电活动达到同步化的主要因素。(2)促进神经元的生长、分化。在不成熟的神经细胞以及出生后不久的神经元中，神经元之间缝隙连接信号传导表现出显著优势；因此，在神经网络环路形成、皮层发育的过程中，缝隙连接间的信号传导有至关重要的作用。在中枢神经系统成熟以后，神经元间的缝隙连接逐渐减少，但仍存在一些神经元细胞之间的缝隙连接介导的电信号传导，并参与神经损伤后的再生与重塑。(3)介导第二信使的传递。缝隙连接蛋白Cx36与中枢神经系统神经元网络活动的调节，与第二信使(Ca2+、cAMP及IP3等)以及一些必需代谢产物的交换密切相关。中枢神经系统的神经细胞间缝隙连接通透性强，第二信使及一些必需代谢产物通过缝隙连接在细胞间传递，以实现并协调其生物效应。(4)实现神经元的自我识别。如果机械地把存在于同一神经元上的两个生长锥分离下来，那么被分离下来的两个生长锥之间可以通过自我识别，迅速地在彼此之间再次形成缝隙连接。(5)参与记忆、认知。如果对神经元长时间强化刺激，可增加缝隙连接的通透性，同时学习和记忆能力得到提升，表明缝隙连接可能参与学习和记忆过程。

1.3 缝隙连接蛋白的调节因素缝隙连接蛋白半通道的开放可被诸多因素调控，具有较大的可塑性。细胞间信号传导可由缝隙连接的数目、分布、分子结构的改变来调控。缝隙连接调节过程主要有变换构象、聚集、去聚集、降解等。有研究发现，缝隙连接通道的变换构象、聚集、解体、降解以及通道开闭，可以通过磷酸化的调控来实现[2]。细胞间信号传导的调节可通过改变缝隙连接蛋白的磷酸化状态来实现，胞内磷脂酶可催化缝隙连接蛋白使其去磷酸化[1]。同时，细胞内Ca2+浓度也可以调控缝隙连接通道的开闭[2]。细胞质内pH值亦可调控缝隙连接通道的开闭以影响其电导性。缝隙连接蛋白的转录及转录后的调控也参与缝隙连接蛋白开闭的调节。缝隙连接通道的形成过程及缝隙连接数目的改变受一些长时间作用因素的影响，如激素水平失衡等因素均可影响缝隙连接通道的形成及其通透性。激素可通过cAMP作用，增强细胞间缝隙连接的细胞信号传导程度[14]。

2 缝隙连接蛋白在心脏、神经系统疾病中的作用研究现状

2.1 心脏及神经系统疾病对缝隙连接蛋白Cx43、Cx36表达水平的影响缝隙连接蛋白Cx43在心肌细胞的表达水平也是近年来研究的热点。中层心肌与心内、外膜下心肌间Cx43蛋白表达不一致，这是左心室存在心肌横断面上复极离散的蛋白基础[15]。此外，Cx43蛋白的表达下降可能是低温造成心室复极不均一性增大的原因之一[16]。

Cx36作为唯一在神经系统中优先表达的缝隙连接蛋白，参与了癫痫的发作过程，癫痫是神经系统常见病，发病率较高，其中难治性癫痫治疗效果差，严重影响患者生活质量[17-19]。Cx36已逐渐成为神经电生理领域的研究热点[20-22]。目前，Cx36在癫痫患者脑细胞中的表达有争议，有研究报道，在癫痫发作过程中Cx36在海马中的表达水平明显升高[23]，但是也有学者认为癫痫过程中Cx36在海马的表达量没有改变甚至有所下降[24-25]。WU等[22]研究发现，Cx36的表达可以呈一系列动态变化过程，不同时间点表达变化不同，可以随时间变化呈先升高后降低的动态变化过程。

2.2 缝隙连接蛋白Cx43、Cx36对细胞间正常电活动的影响在心血管系统中，Cx43是心室肌细胞缝隙连接的主要构成蛋白，其数量、分布、磷酸化水平等因素均影响心肌细胞电活动的传递，在维持心肌细胞的正常生理活动中起重要作用，是心肌细胞间电传递的关键因素[1-2]。缝隙连接蛋白Cx43在心肌中呈节律性表达，这种节律性可能受到生物钟系统的调节。缝隙连接通道异常可导致心室肌细胞的整体性异常，使传导速度和方向发生异常改变[2]。

有学者认为，癫痫发作是由于脑内不同部位脑细胞兴奋性与抑制性递质的不平衡所致[26]。癫痫发病机制复杂多样，除上述因素以外，离子通道结构功能的异常、神经胶质细胞、免疫因素及缝隙连接等因素亦参与癫痫的发生、发展及维持。神经元异常放电是癫痫的电生理基础。研究表明，神经元之间信息传递是以动作电位传递为基础的，神经元网络同步化电活动是信息传递的基本方式和神经功能实现的基础，但过度同步化放电是导致癫痫发生的电生理学原因[27]。随着对缝隙连接研究的深入，发现在痫性电活动中经电信号传递介导的同步化机制扮演着重要角色，其发挥作用主要是通过缝隙连接实现[28-30]。

癫痫患者存在相应的中枢神经系统结构和功能的改变，这些改变既可能是癫痫的原因又可能是癫痫的结果。有关癫痫患者脑组织结构改变的研究，一直是人们关注的焦点。某一细胞受到刺激，或者接受到外界某种信息，其离子电位改变并通过缝隙连接迅速将离子或其他调节信号传递给相邻细胞，完成机体的整体功能调节，这种电紧张突触联络是中枢神经系统重要的同步化机制[31]，而同步化在癫痫发病中具有重要作用。WU等[22]研究发现，神经元缝隙连接蛋白Cx36可通过增加电突触的数目，增强电传导性，进而使电突触耦联的数目增加，促进神经元的同步放电，增加癫痫产生的可能性。在病理情况下，缝隙连接参与神经元电活动，引起电突触数目增加以及电传导性增强，通过电紧张突触传递，作用于同步化机制，使电突触耦联的神经元数目增加，进一步促使神经元的同步化放电，从而增加癫痫产生的可能性。越来越多的实验表明，神经元之间的缝隙连接通道是形成上述同步化放电的重要因素[32]。

2.3 缝隙连接蛋白Cx43、Cx36在心脏、神经系统疾病异常电活动中的作用心律失常是循环系统常见疾病，是危及生命的重要疾病[33-35]，其可单独发病，也可并发其他心血管系统疾病，病因主要是心肌细胞的异常兴奋性增加。近年来，随着对心肌细胞超微结构的研究，发现心律失常与心肌细胞超微结构的破坏有关[36-38]。Cx43是心室缝隙连接通道的主要物质基础，其分布和表达异常可导致心肌细胞兴奋性异常，从而引起细胞间传导速度减慢以及传导方向发生改变，导致折返性心律失常[2]。因此，Cx43很可能成为心律失常治疗的新靶点。

癫痫病因很复杂，是一个反复的病理生理过程，具有以下特点[39]：(1)反复自发性癫痫发作；(2)海马、杏仁核等边缘系统与癫痫密切相关；(3)癫痫脑部可有病理改变，如海马硬化；(4)对抗癫痫药物耐药。针对癫痫的病因、致痫机制和治疗的研究尚需完善。

研究表明，海马是癫痫的常见起始部位之一，异常放电可从海马起始并扩散至整个Papez网络环路[40]。海马是边缘系统的一个重要结构，不仅与认知、记忆等方面密切相关，在神经系统疾病的发生方面也起到非常重要的作用，可能是由于海马对缺血、缺氧以及某些兴奋性氨基酸毒性等因素较为敏感；除此之外，海马神经元兴奋性高亦可能与海马易受损伤有关。海马区域的神经元细胞中Cx36的含量较其他部位更高[41]。随着相关研究的进一步深入，海马与癫痫之间的关系将会受到进一步的重视。

3 缝隙连接阻断剂的研究现状

心肌梗死后大鼠心肌组织Cx43去磷酸化，心室颤动阈值降低，应用美托洛尔可促进Cx43的磷酸化，从而逆转心电传导异常[42]。Cx36与癫痫相关性的体外及体内研究发现，缝隙连接阻断剂可以作为新型抗癫痫药物，尽管其尚未应用于临床[29-31]。

缝隙连接及缝隙连接阻断剂的研究，有可能成为癫痫发病机制及治疗领域最有价值的研究热点。缝隙连接可以促进神经元之间的超同步化放电而引起癫痫，应用缝隙连接阻断剂可减轻痫性发作及神经元放电的程度，缝隙连接阻断剂有望成为抗癫痫治疗的新药[43]。目前，常用的缝隙连接阻断剂有：(1)非选择性缝隙连接阻断剂。如丙酸和丙酸钠，通过调节细胞内酸化程度来调节缝隙连接的开放。此外，还有庚醇和辛醇，二者属于长链醇类，而乙氟醚属于麻醉类药物，甘珀酸和18α-甘草次酸属于甘草次酸衍生物。研究较多的是甘珀酸，为一种非选择性广谱抑制剂，同时具有浓度依赖性，可使Cx43、Cx36表达减低。(2)缝隙连接选择性阻断剂。神经元的选择性阻断剂主要有奎宁、奎尼丁和甲氟奎。奎宁是一种抗疟药[43-44]，新近发现其能选择性阻断Cx36介导的缝隙连接细胞间信号传导，且阻断作用具有可逆性和剂量依赖性。最近，还有一些体外研究报道了奎宁在不同致痫模型上具有抗惊厥作用[44-45]。因此，缝隙连接阻断剂有可能成为研究的新热点。

4 展望

细胞间的缝隙连接有传导速度快、阻抗小的特点，在细胞间电活动传递中起到重要作用，在心肌细胞、神经细胞电传递相关疾病中，缝隙连接发挥了重要作用。因此，缝隙连接通道可能参与心脏、神经系统电生理相关疾病的发生、发展及维持。缝隙连接蛋白Cx43、Cx36可能通过增加电突触的数目，使电传导性增强，促进细胞间电活动，增加疾病产生的可能性。因此，以缝隙连接为靶点，开展对其作用机制及其阻断剂的研究，有益于新型治疗药物的研发。