刺山柑体外抗肿瘤活性提取物的筛选研究

买地哪木·色迪克，周彦霞，周晓涛，王 梅（.新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 800；新疆医科大学研究生院，新疆 乌鲁木齐 800；新疆医科大学基础医学院，新疆 乌鲁木齐 800）

刺山柑（capparis spinosa L.）为山柑科山柑属藤本植物，又名老鼠瓜、野西瓜，是一种中草药[1]。主要分布于中东地区和地中海国家，在我国主要分布于新疆、甘肃、西藏等地区[2]。刺山柑是干旱区特有植物，抗旱、耐高温、耐风蚀、耐贫瘠，是研究植物抗逆性不可多得的材料[3]。刺山柑含有挥发油、生物碱类、类黄酮类、萜类以及芥子油甙等化学成分[4]，其叶、果、根皮均可入药，味辛苦，性温，具有祛风、除湿、通鼻窍、祛瘀止痛活血之功效，在新疆作为一种民族医药而被广泛应用[5]。现代药理研究表明刺山柑果实提取物在抗菌、抗炎、抗氧化、抗高血压[6]、抗肿瘤、降血糖、调血酯、利尿、治疗痛风和风湿[7-8]等方面均有一定的功效。有多名国外学者报道了刺山柑对肺癌、卵巢癌、肠癌、乳腺癌和鼻咽癌均有作用[9-12]。本研究以多种肿瘤细胞为细胞模型，探讨刺山柑的抗肿瘤活性。

1 材料与方法

1.1 药品

刺山柑果药材（购自安徽省金芙蓉中药饮片有限公司，批号：170401，经新疆医科大学药学院天药/生药教研室鉴定）；甲醇、乙醇、盐酸等试剂均为分析纯；水为重蒸水；人非小细胞肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7、人卵巢癌细胞SK-OV-3、人前列腺癌细胞PC-3、人肝癌细胞Hep-G2、人结肠癌细胞HT-29，均购自于中国科学院细胞库；高糖DMEM培养基（规格：500 mL，批号：AD19446264，HyClone公司）；FBS（规格：100 mL，批号：M048-6，美国Sciencell公司）；CCK-8（规格：1 g，批号：M2128，美国Sigma公司）；顺铂（cisplatin，DDP，规格：25 mg，批号：SJJMI-IE，东京化成工业株式会社）。

1.2 仪器与设备

DC-NSG型实验型提取浓缩机组（上海达成实验设备有限公司）；R-2003型旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司）；HWS24型电子恒温水浴锅（上海-恒科学仪器有限公司）；SHZ-95B 型循环水式多用真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；DZF-6051 型真空干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；BSA124S型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；3111 型CO2培养箱（美国Thermo 公司）；DMIL 型倒置显微镜（德国Leica公司）；CJ-1F型医用净化工作台（苏州冯氏实验动物设备有限公司）；MR-96A型酶标仪（深圳迈瑞公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取 取刺山柑干燥果实5 kg，粉碎成粗粉，装袋，加入8 倍量85%乙醇回流提取2 次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩（50 ℃），减压干燥（50 ℃）成乙醇总提取物。取乙醇总提取物800 g，用1 L水溶解后，分别用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取3次，所得萃取液合并后，减压浓缩并干燥，得石油醚提取物、氯仿提取物和乙酸乙酯提取物。剩余的水溶液部分减压浓缩后干燥得水溶性提取物。

1.3.2 细胞株及培养条件 人非小细胞肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7、人卵巢癌细胞SKOV-3、人前列腺癌细胞PC-3、人肝癌细胞Hep-G2、人结肠癌细胞HT-29，均购自于中国科学院细胞库，把DMEM通用培养液配制成含有10%胎牛血清，1%抗生素（100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素）的完全培养液，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养上述六种细胞，根据细胞生长情况，平均每隔1 ～ 2天更换1次细胞培养液，当细胞密度达到90%时，用含有0.25%的胰蛋白酶消化细胞进行传代，至对数生长期备用。

1.3.3 体外抗肿瘤活性测定 取对数期生长的A549、MCF-7、SK-OV-3、PC-3、Hep-G2、HT-29细胞以每孔5×103个细胞接种于96 孔细胞培养板中，待12 h 细胞贴壁后，设置正常对照组、阳性对照药（DDP）组、样品组（5000、1500、500、150、50、15 μg·mL-1），每组5个复孔。正常对照组以完全培养液孵育细胞，样品组分别以含终浓度为5000、1500、500、150、50、15 μg·mL-1样品的完全培养液孵育细胞，DDP 组分别以含终浓度为100、30、10、3、1、0.3 μmol·L-1样品的完全培养液孵育细胞。按上述处理方式孵育细胞72 h 后在每孔中加入CCK-8 试剂20 μL，继续培养4 h 后在490 nm 处测量各孔的吸光度（OD 值）。以正常对照组OD值为100%细胞活力，其余各组OD值与正常对照组OD值的比值为相对活力。以相对活力评价样品对A549、MCF-7、SK-OV-3、PC-3、Hep-G2、HT-29细胞的毒性。按下列公式计算生长抑制率，采用SPSS 16.0 统计软件对数据进行处理，采用Bliss 法计算IC50。生长抑制率=（1-用药组OD值/对照组OD值）×100%。

2 结果与分析

刺山柑乙醇总提取物经石油醚、氯仿、乙酸乙酯等溶剂萃取，分别得到56.39 g石油醚提取物、141.58 g氯仿提取物和100.76 g乙酸乙酯提取物。细胞毒性检测结果表明，刺山柑五个提取物对六种人肿瘤细胞具有不同程度的抑制作用，由表1 可知，不同浓度的刺山柑提取物对六种人肿瘤细胞的生长抑制率均随含药量的升高而升高，即呈现出明显的剂量依赖性。由表2 可知，刺山柑各有效提取物对六种人肿瘤细胞的体外半数抑制浓度IC50值在350.503 ～ 1 470.614 μg·mL-1，其中石油醚提取物对人卵巢癌细胞SK-OV-3的IC50值最小，即为350.503 μg·mL-1，其对应的抑制率为95.801%。实验结果表明，石油醚提取物对人卵巢癌细胞SK-OV-3的IC50值最小，即抑制效果最佳。

3 讨论

刺山柑作为常见的药用植物之一，具有抗炎镇痛、抑菌、抗氧化、降血糖、抗肝毒、抗肿瘤等多种药理作用[13]。研究表明，刺山柑果实中油酸的含量达到42.93%，油酸可降低血液总胆固醇和有害胆固醇，减少其在血管上的沉积，有预防动脉硬化等作用，却不降低有益胆固醇，对心血管疾病和癌症等都有预防作用[14]。

表1 刺山柑各有效提取物对六种人肿瘤细胞的生长抑制率的影响Tab 1 Growth inhibition rate of six human tumor cells by different effective parts of capparis spinosa L.

表2 刺山柑各有效提取物对六种人肿瘤细胞的IC50值. μg·mL-1Tab 2 IC50 values of various active parts of capparis spinosa L. on six human tumor cells. μg·mL-1

目前，对刺山柑抗肿瘤活性的研究较少，近几年有关刺山柑的研究主要集中在药理作用和化学成分的研究，关于刺山柑抗肿瘤活性的药效学研究并不明确。在本研究中，采用抗肿瘤药物筛选常用的CCK-8法，以DDP 为阳性对照，基于常见的人非小细胞肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7、人卵巢癌细胞SK-OV-3、人前列腺癌细胞PC-3、人肝癌细胞Hep-G2和人结肠癌细胞HT-29这六种人肿瘤细胞，考察刺山柑石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、水提物和醇提物的抗肿瘤活性，结果发现刺山柑的五个有效提取物对六种人肿瘤细胞均有生长抑制作用。其中以石油醚提取物对人卵巢癌细胞SK-OV-3 抑制作用最强，其对应的IC50值和最大抑制率分别为350.503 μg·mL-1和95.801%。本研究评价了刺山柑不同提取物对不同肿瘤细胞的活性，成功筛选出了活性最强的提取物，为今后刺山柑抗肿瘤活性研究提供了理论参考。然而，有关刺山柑抗肿瘤的药效成分物质基础、抗癌机理等方面仍有待进一步的研究。