黄硝创伤方抑菌有效药味优选研究

张玉萌，何新荣，栗晓东，魏 静（.中国人民解放军总医院医学保障部药学部中药房，北京 0085；.北京交通大学社区卫生服务中心，北京 00044；.天津医科大学药学院，天津 00070）

创面治疗是临床医学上独具挑战的难题之一，其治疗是一个复杂且动态的过程，且愈合机制具有多样性[1]，其中创面感染是创面难治愈的重要原因[2]，有临床报道创口感染是致死的主要原因[3]，而近年来抗生素的滥用、误用使得机体产生耐药性的问题不容忽视[4-5]。在中医理论指导下，长期临床实践证明有不少中草药作为一种天然的抗菌药物，其通过调整机体功能状态实现抑菌作用[6]，因此，用中草药代替化学药物治疗创面感染疾病，无残留、无耐药性、无毒副作用的优点而具有远大发展前景。黄硝创伤方为临床经验方，由五倍子、大黄、芒硝、白及和甘草组成，具有清热消肿、敛疮生肌等功效，临床上外用主治战、创伤等外伤出血证，有很好的止血、止痛、消肿生肌的药效。本试验拟以体外抑菌作用为指标，采用正交t值法对黄硝创伤方中主要药味进行分析及优化组合研究，进而进行抑菌试验，旨为开发黄硝创伤方在临床中的合理使用提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂

大黄（产地：四川；生产批号：17062001）、生甘草（产地：内蒙古；生产批号：17060901）、五倍子（产地：四川；生产批号：17072502），以上三种药材均购于北京绿野药业有限公司；芒硝（产地：陕西；生产批号：1707096）购自北京盛世龙药业有限公司；白及粉（产地：贵州；生产批号：SA6151）购自北京华邈药业有限公司。营养琼脂培养基由中国人民解放军总医院检验中心微生物室按要求配制。

1.2 实验菌种

金黄色葡萄球菌ATCC25933 标准菌株，临床耐药菌株肠球菌（青霉素G、氨苄西林、庆大霉素、链霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、红霉素、利奈唑烷、万古霉素、四环素、替加环素、呋喃妥因均耐药），由中国人民解放军总医院微生物科提供。

1.3 仪器与设备

YB-400A型中药粉碎机（永康市速锋工贸有限公司），HZQ-X100振荡培养箱（常州市固德仪器有限公司），JC-STZK18L压力蒸汽灭菌锅（青岛聚创环保设备有限公司），FA-1004电子天平（上海精科仪器有限公司），DK-98-IIA电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司），KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司），DHP060型恒温培养箱（上海实验仪器厂有限公司），101A 系列电热鼓风干燥箱（上海实验仪器厂有限公司），SW-CJ-1F医用型洁净工作台（苏州安泰空气技术公司）。

2 实验方法

2.1 设计及分组

处方中5 味中药构成5 个因素，各因素均取用药为水平1、不用药为水平2，因素水平见表1。选用 L12（211）正交表，按照正交设计安排12组实验，拆方方法见表2、表3。

2.2 中药提取物的制备

根据处方组成，分别称取大黄、芒硝、五倍子各30 g，生甘草10 g，白及粉10 g（包煎）若干份，按正交t 值表安排，将不同配伍的药物粉碎，用适量水浸泡2 h，加入八倍量水煎煮两次，每次30 min，两次药液合并，浓缩至40 mL，高温灭菌，密封，4 ℃保存备用。

表1 正交 t 值法因素水平表Tab 1 Factor level table of orthogonal t value method

表2 黄硝创伤方及其拆方对金黄色葡萄球菌抑菌效果Tab 2 Antibacterial effect of HX and its different components against Staphylococcus aureus

表3 黄硝创伤方及其拆方对肠球菌抑菌效果Tab 3 Antibacterial effect of HX and its different components against Enterococcus

2.3 体外抑菌实验

2.3.1 培养基的制备 营养琼脂培养基：牛肉浸膏3.5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖0.1%，氯化钠5 g，蒸馏水定容至1000 mL，调pH 6.7 ～ 7.5，灭菌25 min。

2.3.2 药敏片法 将在药液中充分浸泡好的圆纸片，放入有菌的培养基表面，室温下培养24 h，观察结果，滤纸片周围是否出现抑菌圈及其直径大小可作为判断细菌对该药物的敏感程度的指标。

2.3.3 制作药敏片 在无菌培养皿中倒入5 mL药液，用镊子将滤纸片放入浸泡至充分，取出后放入无菌操作台高温干燥待用。

2.3.4 抑菌实验 在无菌操作台上，将金黄色葡萄球菌、临床耐药肠球菌分别划线接种于平皿培养基上，振荡培养箱中培养12 h后，用接种环挑取适量的细菌培养物，均匀地涂布于琼脂培养基上。用镊子将干燥后的药敏片平贴于培养基表面，使其与表面完全贴合，将琼脂培养基倒置放入培养箱中，37 ℃下培养24 h，观察结果，用游标卡尺测量直径，3次测量取平均值。实验操作中使用的仪器均经过灭菌处理。

2.4 数据处理

根据拆方对2种供试菌D值的贡献分析确定黄硝创伤方优化组合。D值为正值，表示用该药比不用该药对试验菌的抑菌圈大，差异显著，表明抑菌效果显著；D值为负值，表示用该药比不用该药对试验菌的抑菌圈小，差异显著，表明无抑菌效果，并对该方优化组合方进行验证试验。预期药效（MM）计算公式为MM=Mm+，其中Mm为各组抑菌圈直径均数的平均值，D= M1- M2，M1为用某药各组抑菌圈直径的均数之和，M2为未用某药各组抑菌圈直径的均数之和，G为分组组数。

3 结果

黄硝创伤方拆方的抑菌试验结果见表2 和表3，由表2 可知，对金黄色葡萄球菌的最佳抑菌组合为A1B1C1D1E2，预期药效MM1= 15.31+（46.49+ 36.23+10.59+12.71+8.11）/12 = 24.8 mm，且用E与不用差异不显著，说明五倍子、大黄、白及和芒硝为抑制金黄色葡萄球菌的主药。由表3可知，对肠球菌的最佳抑菌组合为A1B1C2D2E2，预期药效MM2= 11.55+（27.91+27.53+3.57+8.47+1.59）/12 = 17.3 mm，且用C、D、E 与不用差异不显著，说明五倍子、大黄为抑制肠球菌的主药。根据拆方对2种供试菌D值的贡献分析确定黄硝创伤方的优化药物组合为五倍子和大黄。验证试验证明该组合对金黄色葡萄球菌和临床耐药肠球菌的抑菌圈直径分别为（19.89±1.11） mm 和（15.58±1.63） mm，五倍子与大黄配伍，对金黄色葡萄球菌有协同抑制作用，而对肠球菌无协同作用。

4 讨论

正交t 值法原理清晰明了，易于实验操作和数据计算，改进后便于分析，多用于因素多、水平少的较大方剂研究，尤其对4 ～ 11味药物适用[7-9]。该方法可进行主要药效分析、辅药交互分析及剂量选择，较适用于中药复方的最佳组合筛选研究。本研究采用正交t 值法作为上述5 种抗炎植物有效成分进行最佳有效成分配伍的筛选工具，进行了有效成分优选复方的初步筛选。结果表明，复方中五倍子和大黄为抑制金黄色葡萄球菌和临床耐药肠球菌的主要有效药味，且五倍子与大黄配伍，对金黄色葡萄球菌有协同抑制作用，而对肠球菌无协同作用。

肠球菌为革兰阳性球菌，在需氧革兰阳性球菌中，它是仅次于葡萄球菌的重要院内感染致病菌，肠球菌亦可引起院外感染。肠球菌不仅可引起尿路感染、皮肤软组织感染，还可引起危及生命的腹腔感染、败血症、心内膜炎和脑膜炎等[10]。因此，本研究选定创伤易感菌金黄色葡萄球菌及耐药性肠杆菌作为研究对象，一方面希望能为临床中该制剂使用提供实验性的依据，另一方面希望缓解致病菌产生耐药性的现状和减少临床上抗菌药物大量使用对人体的危害，并达到更好的治疗效果。抑菌实验中，除了对上述两种革兰阳性菌进行实验，还选择了2个革兰阴性菌即标准大肠杆菌和临床耐药肠杆菌，但结果表明，黄硝创伤方各组对大肠杆菌和耐药性肠杆菌均表现低敏。

本课题是在前期止血、止疼药效研究基础上，拟通过考察该经验处方的抑菌抗炎药效，优化处方大黄、芒硝、五倍子、白及和甘草的药味组成。本经验方中大黄泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄[11]，药理作用主要为泻下、抗菌、止血、抗肿瘤。五倍子敛肺降火，化痰饮，止咳嗽、消渴，其药效成分没食子酸有抗菌、抗病毒、抗氧化、防龋齿等功效。芒硝泻下通便，润燥软坚，清火消肿，在临床多与其他药物配伍使用，也常以外敷为主与大黄合用起协同作用，利于消肿抗炎。白及收敛止血、消肿生肌，有止血凝血、保护胃黏膜及抗细菌、真菌的活性。基于以上中医理论和药理研究结果，可以推断该中药外治经验方，具有托毒生肌，活血化瘀，清热敛疮的功效，在临床应用治疗战、创伤有显著优势。通过黄硝创伤方抑菌有效药味优选实验，结果表明五倍子与大黄是主要药味，芒硝、白及和甘草是辅助药味，同时可以初步推断该经验方对革兰阳性菌有显著抑制作用。下步拟通过辅药交互作用以及剂量选择的正交t 值法确定最佳配比和剂量，结合止痛、止血药效实验数据为该处方复合成新型敷合制剂提供数据依据。