苦参素胶囊对小鼠急性酒精性肝损伤的影响

方 慧，鲁长俊，吕 悦，郑珊娇，俞婷婷，王 寅，郑 英（.中国人民解放军联勤保障部队第九〇三医院，浙江 杭州 3003；.河南省直第三人民医院，河南 郑州 450000）

酒精性肝病是影响人类健康的重要问题，短时间内乙醇的大量摄入可导致肝脏发生严重损伤，即急性酒精性肝损伤（alcoholic liver disease，ALD）。目前对于急性酒精性肝病治疗没有特效的药物，因此，加强对酒精性肝病病因的研究和防治是当前面临的重要课题。苦参素胶囊的主要成分是氧化苦参碱，具有广泛的生物活性。现代药理研究[1]表明氧化苦参碱在稳定肝细胞膜、促进受损肝细胞的修复方面有一定的作用，同时还具有改善肝脏微循环、促使胆红素排泄、抑制肝脏细胞纤维化因子释放等作用。苦参素胶囊主要用于治疗慢性乙型病毒性肝炎，在治疗酒精性肝损伤方面研究报道较少，因此本课题就苦参素胶囊对急性酒精性肝损伤的保护作用进行研究，初步探讨其可能的机制，进一步挖掘苦参素胶囊的临床价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物

ICR 雄性小鼠72 只，体质量25 ～ 30 g，由浙江省动物医学科学院提供，动物合格证号：SCXK（浙）20080033。

1.2 药物及其配制

受试药：苦参素胶囊（江苏正大天晴药业集团股份有限公司，规格：0.1 g，批号：140927302），用蒸馏水配制成浓度为0.03 g·mL-1的药液，4 ℃冷藏保存。

阳性药：联苯双酯滴丸（浙江万邦药业有限公司，规格：1.5 mg，批号：A02141125），用蒸馏水配制成浓度为0.375 mg·mL-1的药液，4 ℃冷藏保存。

造模剂：55 度北京红星二锅头（北京红星股份有限公司，规格：500 mL，产品标准号：GB/T20822），4 ℃冷藏保存。

1.3 试剂与仪器

试剂：考马斯亮蓝、丙二醛（MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，规格：100T/96 样；丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、甘油三酯（TG）试剂盒均购自杭州唐荣科技有限公司。

仪器：东芝ACCUTETBA-40FR 全自动生化分析仪（东芝三厂医疗株式会社）；XHF-b 高速分散器 （宁波新芝生物科技股份有限公司）；LXJ-IIB 低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂制造）；LQA10002 电子天平（杭州友恒称重设备有限公司）；Power Wave340酶标仪（美国Bio-TEK公司）；Thermo离心机。

1.4 动物分组及处理

健康ICR雄性小鼠72只，随机分为正常组、模型组、联苯双酯滴丸组（阳性组）、苦参素低剂量组、苦参素中剂量组、苦参素高剂量组，共6组，每组12只。正常组给予蒸馏水，体积为0.1 mL·10 g-1体重。除正常组外，其余各组动物均参照成人10 倍量灌胃给予55度二锅头，每日灌胃两次，间隔12 h；造模同时，灌胃给予各受试药，连续7 d。

1.5 样品采集与指标检测

末次给药后禁食不禁水，12 h后称体重，摘眼球取血，静置，离心（3500 r·min-1，10 min）得血清，全自动生化分析仪测定ALT、AST、TC、TG、ALP含量。迅速取出肝脏，称量肝湿重，计算肝脏系数（肝脏系数=肝脏重量/体重×100%）。准确称取肝脏0.5 g，用生理盐水制作成10%的肝匀浆液，静置，离心（3500 r·min-1，10 min）取上清液，采用相关试剂盒检测SOD活性及MDA的含量，具体操作方法严格按照试剂盒说明。

1.6 数据统计处理方法

2 结果

2.1 一般行为学观察

实验过程中，正常组小鼠精神状态良好，毛发光泽，食欲佳，动作自如，反应灵敏，无嗜睡现象，排便正常。模型组小鼠均有不同程度的精神萎靡，毛发无光泽，嗜睡，食欲减退，反应迟缓，体重增长缓慢，出现稀便现象。苦参素各剂量组小鼠精神状态与饮食、体重等情况均较模型组有所改善。

2.2 对急性酒精性肝损伤小鼠体重的影响

表1 显示，与正常组小鼠比较，模型组小鼠体重从第4天开始逐渐下降，差异具有统计学意义。与模型组相比，苦参素各剂量组小鼠体重均有所改善。

2.3 对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏系数的影响

表2 显示，与正常组比较，模型组小鼠肝脏系数显著升高，差异具有统计学意义（P ＜ 0.01），表明酒精能导致小鼠肝脏肿大。与模型组比较，苦参素各剂量组均能降低小鼠的肝脏系数，差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）。表明苦参素胶囊可以缓解急性酒精性肝损伤小鼠的肝脏肿大。

2.4 对急性酒精性肝损伤小鼠血清中ALT、AST活性的影响

表3 显示，与正常组比较，模型组小鼠血清中ALT，AST显著上升，差异有统计学意义（P ＜ 0.01）。与模型组比较，苦参素各剂量组均能降低血清中ALT、AST活性，差异有统计学意义（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01）。表明苦参素胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠ALT、AST活性具有一定的改善作用。

表1 对急性酒精性肝损伤小鼠体重的影响. g, x ± s , n = 12Tab 1 Effect of body weight of marine capsule on acute alcoholic liver injury. g, n = 12

表1 对急性酒精性肝损伤小鼠体重的影响. g, x ± s , n = 12Tab 1 Effect of body weight of marine capsule on acute alcoholic liver injury. g, n = 12

注：与正常组相比，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01；与模型组相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01Note: compared with normal group, △P ＜ 0.05, △△P ＜ 0.01； compared with model group, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01

组别 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天 第8天正常组 26.03±1.98 25.84±1.84 25.73±1.83 26.06±1.86 26.43±2.20 27.43±1.93 27.32±1.89 28.46±2.03模型组 27.21±2.27 25.38±2.20 24.43±3.00 21.73±2.75△ 19.54±6.11△△ 20.75±3.00△△21.30±2.82△△21.47±2.73△△阳性组 26.60±1.61 25.61±2.21 24.01±2.44 22.20±2.89* 22.77±3.56* 22.52±3.46* 22.09±3.35** 22.56±3.59*苦参素低剂量组 26.69±1.63 25.31±1.70 24.46±2.07 23.62±2.82 23.55±2.92 22.59±2.16 22.19±2.35 22.57±1.66苦参素中剂量组 26.57±1.63 24.63±1.88 23.28±2.38 23.87±2.52 24.82±2.45 24.17±2.84 23.93±1.95 23.94±1.94苦参素高剂量组 26.96±1.60 24.99±1.97 24.08±2.56 23.60±3.02 23.14±3.31 22.99±3.33 22.44±3.53 22.65±3.79

表2 对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏系数的影响. , n = 12 Tab 2 Effect of liver index of marine capsule on acute lcoholic liver injury. n = 12

表2 对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏系数的影响. , n = 12 Tab 2 Effect of liver index of marine capsule on acute lcoholic liver injury. n = 12

注：与正常组相比，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01；与模型组相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01Note: compared with normal group, △P ＜ 0.05, △△P ＜ 0.01； compared with model group, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01

组别 剂量/g·kg-1 体质量/g 肝重/g 肝脏系数/%正常组 - 26.85±1.05 1.15±0.14 4.276±0.570模型组 - 19.94±2.45 0.99±0.27 4.916±0.866△△阳性组 3.75×10-3 21.28±2.71 0.93±0.16 4.333±0.482*苦参素低剂量组3.75×10-2 20.54±1.33 0.90±0.11 4.384±0.301*苦参素中剂量组0.075 22.43±2.22 1.05±0.17 4.671±0.464*苦参素高剂量组0.150 20.99±3.69 0.91±0.22 4.298±0.533*

表3 对急性酒精性肝损伤小鼠血清ALT与AST活性的影响. n = 12Tab 3 Effect of ALT, AST levels in serum of marine capsules on acute alcoholic liver injury. n = 12

2.5 对急性酒精性肝损伤小鼠血清中TC、TG水平的影响

表4 显示，与正常组比较，模型组小鼠血清中TC、TG 显著性升高，差异具有统计学意义（P ＜ 0.01）。与模型组比较，苦参素各剂量组均能降低血清中TG 水平，中剂量组和高剂量组能降低TC 水平，差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）；苦参素低剂量组具有降低TC水平的趋势。表明苦参素胶囊可以降低急性酒精性肝损伤小鼠血清中TC、TG水平。

2.6 对急性酒精性肝损伤小鼠血清中ALP、LDH活性的影响

表5 显示，与正常组比较，模型组小鼠血清中ALP、LDH 活性显著性升高，差异具有统计学意义（P ＜ 0.01）。与模型组比较，苦参素各剂量组均能降低血清中ALP、LDH水平，差异具有统计学意义（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01）。表明苦参素胶囊可以降低急性酒精性肝损伤小鼠血清中ALP、LDH活性。

表4 对急性酒精性肝损伤小鼠血清中TC、TG水平的影响. n = 12Tab 4 Effect of TC, TG levels in serum of marine capsule on acute alcoholic liver injury. n = 12

表5 对急性酒精性肝损伤小鼠血清中ALP与LDH活性的影响. n = 12Tab 5 Effect of ALP, LDH levels in serum of marine capsules on acute alcoholic liver injury. n = 12

2.7 对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中SOD、MDA含量的影响

表6 显示，模型组小鼠肝组织MDA 含量较正常组显著升高，SOD活性显著降低，差异具有统计学意义（P ＜ 0.01）。与模型组比较，苦参素各剂量组均能显著降低小鼠肝组织中MDA 含量，中、高剂量组明显提高SOD 活性，差异具有统计学意义（P ＜ 0.01）。表明苦参素胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织MDA、SOD水平具有不同程度的改善作用。

3 讨论

ALD 是由于过量摄入酒精而引起肝脏损害的一系列急、慢性病理性改变导致的疾病。初期通常表现为脂肪肝，进而发展为酒精性肝炎、酒精性肝纤维化及肝硬化，严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死甚至肝衰竭[2]。致病因素是长期大量酒精的摄入，但其发病机制尚不完全清楚。文献[3-4]研究表明，氧化应激和氧化应激诱发的脂质过氧化是导致ALD 病理损伤的重要机制之一，氧化应激是指当机体受到有害刺激时，活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）等一些体内高活性分子产生过多，超出抗氧化物的清除能力，打破氧化系统和抗氧化系统之间的动态平衡，从而导致肝脏的损伤。

表6 对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中SOD与MDA水平的影响. n = 12Tab 6 Effect of SOD, MDA levels in liver tissue of marine capsules on acute alcoholic liver injury. n = 12

临床上活性酶ALT 和AST 是反映肝细胞损伤的敏感指标，正常情况下，血清中两种酶只存在于细胞内，血清中很少，活性非常低，当肝细胞病变受损时，肝细胞肿胀，细胞膜通透性增加，肝细胞内ALT 和AST 大量释放入血，导致血清中的ALT 和AST 水平升高[5]。MDA 为机体脂质过氧化的重要终产物，它的增加或减少可反映脂质过氧化程度的增加或减少，因此可以通过检测MDA的含量衡量肝组织过氧化损伤和治疗后肝细胞的恢复情况[6]。在正常生理状态下，肝脏中的抗氧化剂SOD能及时清除氧自由基，使机体免受氧化损伤，当自由基产生过多，超过抗氧化剂的清除能力，使体内氧自由基蓄积，损伤肝细胞，因此SOD 活力的高低可以反映机体清除氧自由基的能力[7]。

苦参素胶囊的主要成分是氧化苦参碱，可以清除氧自由基，抑制氧自由基的释放和磷脂酶的活化，稳定肝细胞膜，促进受损肝细胞的修复，改善肝脏微循环，抑制肝细胞纤维化因子的释放，从而恢复肝细胞功能，保护肝脏[1]。魏红等[8]在研究苦参碱微乳与苦参素胶囊对小鼠急性肝损伤保护作用的对比中发现苦参素胶囊可以使血清中ALT 和AST 水平低于模型组，表明苦参素胶囊对小鼠肝脏具有保护作用。有研究[9]表明，苦参素可以阻止甚至逆转肝脏的纤维化，从而阻止肝脏的恶性发展。

实验结果显示，模型组小鼠血清ALT、AST、ALP、LDH 活性显著升高，TG、TC 水平显著增加（P ＜ 0.01），肝组织SOD活性明显降低（P ＜ 0.05），肝组织MDA 明显升高（P ＜ 0.05）。以上数据表明，急性酒精性肝损伤造模成功。模型组小鼠血清ALT、AST活性明显升高，表明肝细胞膜通透性增大，ALP、LDH、TG、TC水平显著升高，表明肝细胞受到严重损伤。而给予苦参素胶囊治疗后，小鼠肝脏系数，血清中ALT、AST、ALP、LDH活性及TG、TC含量显著降低，说明苦参素胶囊能保护肝细胞，稳定细胞膜的结构和功能，对酒精性肝损伤有一定的保护作用。苦参素胶囊能显著抑制酒精性肝损伤小鼠肝组织中MDA含量的升高，SOD活性显著增强，说明苦参素胶囊通过阻断脂质过氧化，增强小鼠肝脏抗氧化而产生保护肝脏的作用。

综上所述，苦参素胶囊对小鼠急性酒精性肝损伤具有一定的保护作用，其作用机制可能与清除自由基抑制脂质过氧化反应有关，通过增强体内氧化系统和抗氧化系统之间的动态平衡，提高细胞膜的稳定性，从而达到保护肝细胞的目的。本研究结果表明，苦参素胶囊对酒精诱导的急性酒精肝损伤小鼠模型表现出较好的抗损伤作用，提示苦参素胶囊具有广阔的开发前景，值得进一步深入开发。