精神依赖物海洛因对大鼠胚胎发育和脑组织Bax表达的影响

俞发荣，李建军，连秀珍，李登楼，谢明仁

(甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室(甘肃政法大学)，兰州 730070)

统计结果表明，精神依赖物海洛因滥用是目前滥用最严重,危害最大的毒品之一[1]。近年来，在精神依赖物海洛因滥用的人群中,女性滥用人数明显上升[2],其中育龄妇女约占1/5～1/3。动物实验结果表明：精神依赖物海洛因在引起母体损伤[3]的同时，可迅速通过胎盘屏障和胚胎血-脑脊液屏障，对胎儿产生毒性作用[4]。孕妇吸毒1 h后，在胎儿体内测出有海洛因代谢产物吗啡存在。海洛因可直接作用于胚胎发育的各个时期，导致胚胎组织器官发育不全或畸形[5]。前期研究发现，海洛因成瘾大鼠中脑腹侧被盖区(VAT)Bax基因表达水平明显升高[6]。刘学红等[7]应用免疫组织化学法研究发现，在人胚胎舌上皮组织细胞中均有Bax蛋白阳性表达，说明Bax基因参与调控人胚胎组织细胞的分化发育。Bax基因属于Bcl-2基因家族，Bax基因表达不仅拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，而且具有促进细胞凋亡的功能。若Bax基因表达异常,将导致胚胎组组织器官发育畸形[8]。本文在前期研究的基础上,以Wistar大鼠为实验对象，建立海洛因孕鼠模型，在大鼠胚胎发育期给予不同剂量的海洛因，观察海洛因对胚胎发育及脑组织中Bax表达的影响，为研究精神依赖物海洛因的遗传毒性机制积累参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级Wistar大鼠90只(雌60只，雄30只)，体重200～210 g，来源于甘肃中医药大学科研实验中心【SCXK(甘)2015-0001】。实验在甘肃政法大学SPF级动物实验室进行【SYXK(甘)2015-0006】。实验按3R原则给予实验动物人文关怀。伦理委员会审批号：GZF-2019-002。

1.1.2 试剂与仪器

海洛因，含量86.8%，兰州市公安局提供；Bax ELISA kit，上海将来实业股份有限公司提供；酶标仪， Thermo MK3公司提供。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠分组、给药

全部大鼠在SPF级实验室IVC饲育盒饲养7 d，雌:雄按2∶1合笼饲养。合笼第2天用光学显微镜观察阴道拭子涂片，有精子者视为交配“受孕”。将“孕鼠”随机分为：①对照组，10只孕鼠，肌肉注射生理盐水2 mL/(kg·bw)；②海洛因组高剂量组，肌肉注射海洛因64 mg/(kg·bw)；③海洛因中剂量组，肌肉注射海洛因32 mg/(kg·bw)；④海洛因低剂量组，肌肉注射海洛因16 mg/(kg·bw)，每组10只孕鼠。各组均从受孕第7天开始给药，连续给药9 d。

1.2.2 胚胎子鼠发育观察

受孕第20天，乙醚麻醉孕鼠，无痛解剖开腹部，全切取子宫检查吸收胎、死胎及活胎数，并对胎鼠进行体表形态检查。

1.2.3 胚胎子鼠脑组织Bax水平检测

剥取各组胚胎子鼠大脑额叶皮质和小脑皮层，各称取500 mg，用匀浆研磨器研磨，离心机2000 r/min,离心15 min，取上清，用ELISA法检测Bax水平。

1.2.4 标准曲线和标准曲线的直线回归方程制作

以Bax标准品浓度为横坐标，吸光度(OD)为纵坐标做标准曲线和标准曲线的直线回归方程。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 海洛因对大鼠胚胎发育的影响

受孕第20天，解剖开腹部，全切取子宫检查胚胎数、死胎及活胎数。结果发现，海洛因高、中、低剂量组活胚胎总数比对照组减少了48.48%、37.12%和27.27%。(表1)

活体检查看出，海洛因低剂量组胚胎枕骨发育不全，胚胎出现脑膨出畸形；海洛因中剂量组胚胎枕骨、顶骨发育不全，胚胎脑膨出明显；海洛因高剂量组胚胎枕骨、顶骨、颞骨发育不全，胚胎脑膨出更为明显，部分胚胎出现四肢及指骨发育不全。(图1)

表1 海洛因对大鼠胚胎发育的影响Table 1 Effect of heroin on the embryonic development of rats

注A：对照组胚胎。B：海洛因低剂量组胚胎：枕骨发育不全，胚胎出现脑膨出畸形。C：海洛因中剂量组胚胎：枕骨、顶骨发育不全，胚胎脑膨出明显。D：海洛因高剂量组胚胎：枕骨、顶骨、颞骨发育不全，胚胎脑膨出更为明显。图1 海洛因对大鼠胚胎发育的影响Note. A, Embryos in the control group. B, Occipital bone hypoplasia, embryonic encephalocele deformity in the low dose heroin group. C, Embryos in the medium-dose heroin group: occipital and parietal bone hypoplasia, obvious embryonic encephalocele. D, Embryos in the high-dose heroin group: occipital, parietal and temporal bone hypoplasia, and more obvious embryonal encephalocele.Figure 1 Effect of heroin on embryonic development of the rats

2.2 海洛因对胚胎子鼠大脑额叶皮层Bax表达水平的影响

以Bax标准液浓度为横坐标，吸光度(OD)为纵坐标做标准曲线和标准曲线的直线回归方程。(图2)

将胚胎子鼠大脑额叶皮层OD代入直线回归方程，海洛因低、中、高剂量组胚胎子鼠大脑额叶皮层中Bax水平比对照组增加了11.41%、47.06%和83.74%(P< 0.05,P< 0.01)。(图3)

图2 Bax标准曲线和标准曲线的直线回归方程Figure 2 Bax standard curve and linear regression equation of the standard curve

2.3 海洛因对胚胎子鼠小脑组织Bax表达水平的影响

将小脑组织OD代入上述Bax直线回归方程，海洛因低、中、高剂量组胚胎小脑组织中Bax表达水平比对照组增加了17.16%、52.96%和90.01%(P< 0.05,P< 0.01)。(图4)

注：与对照组比,*P<0.05，**P<0.01。下图同。图3 海洛因对胚胎子鼠大脑额叶皮层Bax表达水平的影响Note.*P< 0.05，**P< 0.01 vs. the control group.(The same in the following figures)Figure 3 Effect of heroin on Bax expression level in the rat embryonic brain tissue

图4 海洛因对胚胎子鼠小脑组织Bax表达水平的影响Figure 4 Effects of heroin on Bax expression level in the rat embryonic cerebellar tissue

3 讨论

近年研究表明，精神依赖物海洛因滥用严重影响母体健康[9]，直接损害脑组织神经元[10]、星形胶质细胞[11]、颗粒细胞[12]和免疫系统[13]，使血-脑脊液屏障的通透性发生改变，从而诱导大脑损伤和脑功能异常[14]，引起周围神经损伤[15]，导致神经发生退行性病变[16]。王园园等[17]报道，孕妇滥用海洛因将影响胚胎大脑正常发育,影响子代的学习记忆能力[18]。李重阳等[19]给小鼠仔鼠注射海洛因20 d, 仔鼠下丘脑和海马凋亡细胞及Bax蛋白阳性表达细胞的数明显高于对照组，并随着海洛因剂量的递增阳性表达细胞的数量呈增多趋势。许梓枫等[20]报道，海洛因滥用不仅影响胚胎正常发育，出现宫内死胎、流产、早产，增加新生儿及婴儿死亡的概率，还使子代表观遗传性发生改变[21]。胚胎解剖发现，给予孕鼠海洛因后，活胚胎率明显降低，胚胎表型发育受到干扰。由于胚胎颅骨发育受到干扰，脑膨出畸形胚胎数显著增加，实验结果与许梓枫等报道结果相一致。ELISA法检测发现，胚胎大脑组织细胞Bax表达水平随给予海洛因剂量的增加而升高。结果提示，Bax基因是促进细胞凋亡的主要基因，Bax基因表达的蛋白可能抑制胚胎发育和组织器官的形成，或破坏胚胎新形成组织器官，出现畸形胚胎或死胎。海洛因通过母体干扰胚胎表型和组织器官的发育，诱导胚胎组织细胞Bax基因表达的分子生物学机制有待进一步实验研究。