大鼠毛发作为PFOS暴露指示物的实验研究
2018-10-23孙天骥
孙天骥
(科利特环能科技(大连)有限公司，辽宁 大连 116021)
全氟辛烷磺酰基化合物(Perfluorooctane sulphonate，PFOS)具有良好的热稳定性、化学稳定性、高表面活性及疏水疏脂性能，被广泛应用于人们的日常生活和工业生产中，例如，化学品、化妆品、聚合物添加剂、灭火剂、表面防污剂和电子工业的各种产品中[1-2].PFOS还具有不易挥发、难降解、持久性、生物蓄积性和多种毒性的特点，使其在全世界范围内分布广泛，并严重威胁着人类的安全和健康[3].因此，PFOS作为一种全球性污染物，对于全球环境影响的广度和深度以及对于生物圈影响的很多不确定性，已引起了各国科学工作者的广泛关注，使得其成为环境学研究的热点之一.
目前，评价人类体内PFOS负荷的暴露指示物一般通过人体体液，诸如血清和全血等.也有研究显示指甲也是一种良好的暴露指示物[4-5].但是，血液样品存在易污染、不易收集、不易储存运输、样品浓度受采样时间影响较大等缺点；指甲样品虽然成分单一，便于测量，干扰因素较少，但是采集较为困难.事实上，头发也可作为PFOS暴露指示物，目前对于头发样品的此类研究比血液样品要少得多，还缺乏相关研究数据和结论.与指甲相比，头发具有易于采集、贮存和运输等特点，因而适用于大量人群尤其是较为敏感的儿童群体的暴露评价.由于头发在生长过程中深入体液，可以反映PFOS的长期暴露并对暴露历史进行追溯[6].作为非损伤性生物基质，头发已经广泛应用于人体内微量元素、重金属的检测和多氯联苯等持久性有机污染物的暴露评价.本文通过Wistar大鼠的母鼠和子鼠的动物实验，将子鼠毛发作为暴露指示物，检测其对于PFOS的暴露指示作用.
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Agilent RRLC/6410B(美国安捷伦科技有限公司)液相色谱-质谱联用仪，DT5-5(BGPLF公司)低速台式离心机，MS10(德国IKA公司)磁力搅拌器，ZHWY-334(上海智城分析仪器制造有限公司)多功能脱色摇床.
染毒试剂:PFOS(CAS编号1763-23-1,纯度98%)，出厂商：Fluka (Milw-aukee,WI,U.S.A)；
离子对试剂：色谱级四丁基硫酸氢铵(TBAHS)，出厂商：Fluka (Morris Plains,NJ)；
萃取溶剂：甲基叔丁基醚(methyl-tert-butyl ether，MTBE)，出厂商：Sigma-Aldrich (St.Louis,MO,USA)；
复溶试剂：乙腈acetonitrile (ACN)，出厂商：Sigma-Aldrich (St.Louis,MO,USA)；
高效液相色谱流动相(High performance liquid chromatography，HPLC)：色谱级乙酸铵、色谱级甲醇；
洗涤剂：非离子表面活性剂(1% TritonX-100)；
氢氧化钠，出厂商：Sigma-Aldrich (St.Louis,MO,USA)；
脱PFAAs水(即Milli-Q水)，出厂商：Waters Oasis HLB Plus cartridges (Milford,MA).
1.2 样品采集与前处理
1.2.1 实验动物和动物处理 本文采用Wistar大鼠的母鼠和子鼠进行实验，可将母鼠和子鼠的染毒分为4种情况：
(1)母鼠与子鼠均不染毒记为CC组即对照组(子鼠出生前后均无持续PFOS暴露);
(2)母鼠不染毒而子鼠染毒记为CT组(子鼠出生前不暴露于PFOS，出生后哺乳期的子鼠持续暴露于PFOS);
(3)母鼠染毒而子鼠不染毒记为TC组(在胚胎期子鼠持续暴露于PFOS，但出生后子鼠不暴露于PFOS);
(4)母鼠与子鼠均染毒记为TT组(子鼠在胚胎期和哺乳期均持续暴露于PFOS).
将染毒母鼠和未染毒母鼠分别进行配种，母鼠的怀孕周期是21d，待母鼠生育后，再选择出生后健康的子鼠进行培育，饮水中PFOS浓度为5 mg/L的实验母鼠和子鼠的编号下角标为5；饮水中PFOS浓度为15 mg/L的实验母鼠和子鼠的编号下角标为15.
1.2.2 样品采集 根据子鼠毛发的不同采样时间PND21(子鼠出生后21 d)、PND28(子鼠出生后28 d)、PND35(子鼠出生后35 d)、母鼠和子鼠的4种染毒情况(CC、CT、TC和TT)以及2种染毒浓度(5 mg/L和15 mg/L)分别将子鼠毛发剪下，编号装入干净的塑料袋中，每组样品采集5只不同子鼠的毛发，再将毛发置于15 mL聚丙烯离心管中.
1.2.3 样品前处理 根据一些头发中有毒和基本微量金属含量的研究方法[6]，实验使用1% TritonX-100洗涤子鼠毛发样品，再用脱PFOS水超声振荡清洗.将子鼠毛发烘干，称量并记录毛发重量.
将烘干的毛发样品置于聚丙烯离心管中，加入1 mL (2.5 mol/L)的NaOH溶液，在80 ℃条件下水浴消化12 h.待子鼠毛发样品完全消化后，用5 mol/L的HCl溶液将pH值调节至中性.向消化液中加入1 mL四丁基硫酸氢铵(TBAHS)作为离子对试剂，5 mL叔丁基甲醚(TBME)为萃取剂.
振荡萃取20 min，3 000 rpm离心10 min，取出上层有机液体置于另一个聚丙烯离心管中，再加入5 mL TBME重复萃取.将2次萃取的萃取液合并，在50 ℃条件下用平缓氮气流吹干.加入1 mL乙腈复溶，涡旋10 s，超声10 min.
使用尼龙膜过滤，取800 μL于1.5 mL离心管中，50 ℃条件下用平缓氮气流吹干，加入0.4 mL乙腈重新溶解，涡旋5 min，加入0.6 mL脱PFOS水，超声10 min.采用LC-MS/MS测定PFOS浓度.
1.2.4 质量控制与保证 为避免并控制可能存在的外源性污染，实验器皿均采用聚丙烯材质，使用前用甲醇淋洗2次，每批样品都设置全程空白实验.子鼠毛发样品在处理前使用1% TritonX-100进行洗涤.为排除外源性污染对本实验的影响，实验中设置对照组，测量环境中不可控的外源性污染物浓度.本实验选用T检验考察暴露组的差异性是否显著，分析软件使用SPSS，置信水平为 α≤0.05.
2 结果与讨论
对照组(即CC组)中的5个子鼠体内检测的PFOS平均浓度不高于1.46E-04 ng/g，其中,单次检测子鼠体内PFOS浓度不高于2.83E-04 ng/g，这个结果对于PND21、PND28和PND35的组别都是一致的.这说明未经过染毒的子鼠体内PFOS含量极低.由于这些子鼠是由对照组中未染毒的母鼠所生并喂养，说明对照组中的子鼠在胚胎期和哺乳期的进食过程中只存在微量从环境中被动摄入的PFOS污染物，可以认为实验环境中无PFOS暴露，因而不会对其它各组子鼠毛发中PFOS浓度的研究结果产生影响.
对于CT组和TC组，当采样时间为PND21且无论染毒浓度为5 mg/L或15 mg/L，在胚胎期(TC组)子鼠毛发中检测的PFOS平均浓度均高于哺乳期(CT组)(见图1)，说明子鼠在胚胎期经由暴露组中母鼠所生的摄入途径，比从哺乳期经由暴露组中的母鼠所喂养的摄入途径更容易富集PFOS污染物.
当采样时间为PND28时，若染毒浓度为15 mg/L时，TC组子鼠毛发中检测的PFOS平均浓度仍高于CT组，但是当染毒浓度为5 mg/L时，TC组子鼠毛发中检测的PFOS平均浓度却低于CT组(见图2)，这说明采样时间达到28 d时，TC组子鼠毛发中检测的PFOS平均浓度开始明显下降，表明该组子鼠对PFOS的排泄能力开始显现.
当采样时间为PND35时，无论染毒浓度为5 mg/L还是15 mg/L时，CT组子鼠毛发中检测的PFOS平均浓度反过来都高于TC组(见图3)；在染毒浓度分别为5 mg/L和15 mg/L的情况下，PND35的P值分别为0.059和0.128(Sig双侧)均大于0.05，说明数据差异显著.这说明当采样时间达到35 d时，在TC组子鼠毛发中检测的PFOS平均浓度开始明显下降，表明在TC组子鼠对于PFOS的排泄能力持续作用下，其体内PFOS平均浓度下降.
图1所示染毒浓度为5 mg/L和15 mg/L时，分别从PND21中每组5个采样子鼠毛发中检测的PFOS浓度平均值在CT组中差别不大，而在TC组差别较大.并且TC组的PFOS浓度平均值高于CT组.
图2所示，染毒浓度为5 mg/L和15 mg/L时，分别从PND28中每组5个采样子鼠毛发中检测的PFOS浓度平均值在CT组中差别不大，而在TC组差别较大，染毒浓度为5 mg/L时TC组子鼠毛发中检测的PFOS浓度已经低于CT组.
图3所示，在CT组和TC组中，染毒浓度为5 mg/L和15 mg/L时，分别从PND35中每组5个采样子鼠毛发中检测的PFOS浓度平均值差别不大，而CT组的PFOS浓度平均值已经高于TC组.
从图3还可以看到，出生时间为PND35时，无论CT组还是TC组，PFOS暴露浓度为5 mg/L的子鼠与PFOS暴露浓度为15 mg/L的子鼠体内的PFOS浓度平均值都基本相当.这说明PFOS摄入量的增加对哺乳期和胚胎期子鼠的PFOS暴露负荷影响不大，这意味着在哺乳期和胚胎期内子鼠富集PFOS的能力有限.
对于由暴露于PFOS的母鼠生育并继续哺乳的TT组的子鼠(见图4～6)，染毒浓度为5 mg/L时,PND28的每组5个采样子鼠毛发中PFOS浓度平均值为1.20E-02 ng/g；而染毒浓度为15 mg/L时，PND28的每组5个采样子鼠毛发中PFOS浓度平均值为2.37E-02 ng/g.对于PND35的每组5个采样子鼠，染毒浓度为5 mg/L时，子鼠毛发中PFOS浓度平均值为7.78E-03 ng/g，而染毒浓度为15 mg/L时，子鼠毛发中PFOS浓度平均值为1.51E-02 ng/g(见图6);可见，染毒浓度为15 mg/L的子鼠毛发中PFOS浓度的平均值几乎是染毒浓度为5 mg/L时的2倍，这与CT组和TC组的情况不同.由此可以看出，与CT组和TC组相比，TT组子鼠体内PFOS负荷在出生后一个月内快速增长.这说明，在胚胎期与哺乳期中子鼠连续暴露于PFOS的情况下，TT组的子鼠毛发中PFOS浓度在一个月内(28 d)的增长很迅速，而且染毒浓度越高子鼠毛发中PFOS浓度的平均值越大.从图6还可以看出，两种染毒浓度情况下的数据虽有一定波动，但是，当子鼠出生一个月后(例如35 d)，其毛发中PFOS浓度都呈现了下降趋势，当染毒浓度为15 mg/L时，下降趋势更为明显.这表明子鼠对于PFOS有一定的排泄能力，而且对较高浓度的PFOS有较强的排泄能力.
对于PND21的每组5个采样子鼠，在染毒浓度分别为5 mg/L和15 mg/L 时，检测出的子鼠毛发中PFOS浓度的平均值存在CT组 图4所示，TT组中，在染毒浓度为5 mg/L和15 mg/L时，分别从PND28 中每组5个采样子鼠毛发中检测的PFOS暴露浓度. 图5所示，TT组中，在染毒浓度为5 mg/L和15 mg/L时，分别从PND35中每组5个采样子鼠毛发中检测的PFOS暴露浓度. 图6所示，TT组中，染毒浓度为5 mg/L和15 mg/L时,PND35中每组5个采样子鼠毛发中检测的PFOS浓度平均值低于PND28的PFOS浓度平均值. 图1 染毒浓度为5 mg/L和15 mg/L时，分别从PND21 图2 染毒浓度为5 mg/L和15 mg/L时，分别从PND28中中每组5个采样子鼠毛发中检测的PFOS浓度平均值 每组5个采样子鼠毛发中检测的PFOS浓度平均值 图3 染毒浓度为5 mg/L和15 mg/L时，分别从PND35 图4 染毒浓度为5 mg/L和15 mg/L时，分别从 中每组5个采样子鼠毛发中检测的PFOS浓度平均值PND28中 每组5个采样子鼠毛发中检测的PFOS暴露浓度 图5 染毒浓度为5 mg/L和15 mg/L时，分别从 图6 染毒浓度为5 mg/L和15 mg/L时,PND35 PND35中每组5个采样子鼠毛发中检测的PFOS暴露浓度 中每组5个采样子鼠毛发中检测的PFOS浓度平均值 图7所示，当采样时间为21 d时，染毒浓度为5 mg/L/和15 mg/L时，分别从PND21中每组5个采样子鼠毛发中检测的PFOS浓度平均值，可见CT组 图8所示，当采样时间为35 d时，染毒浓度为5 mg/L和15 mg/L时，分别从PND35中每组5个采样子鼠毛发中检测的PFOS浓度平均值，可见TC组 图7 染毒浓度为5 mg/L/和15 mg/L时，分别从PND21 图8 染毒浓度为5 mg/L和15 mg/L时，分别从PND35 中每组5个采样子鼠毛发中检测的PFOS浓度平均值 中每组5个采样子鼠毛发中检测的PFOS浓度平均值 根据上述4种染毒情况下子鼠毛发中PFOS的检测结果，本实验采用的方法可以明显分辨出子鼠在胚胎期与哺乳期期间对于不同浓度的PFOS的暴露差异.因此，依据该实验方法可以通过对子鼠毛发中PFOS浓度的测量，准确地反映出子鼠在胚胎期和哺乳期中PFOS的暴露情况.上述实验结果表明，本实验所采用的PFOS分析方法是有效可行的，可以依据此方法继续进行人体头发中PFOS暴露情况的研究. 本项研究采用大鼠的子鼠毛发作为其体内PFOS的暴露指示物，实验结果表明，随着胚胎期和哺乳期子鼠摄入PFOS浓度的增加，在毛发中检测出的PFOS浓度也相应地增加，由此可以建立子鼠毛发中PFOS的检测分析方法.根据本实验可以得出以下结论：在胚胎期和哺乳期持续染毒的子鼠(TT组)对于PFOS的暴露最强；当子鼠出生时间在3周内，例如PND21，胚胎期子鼠对于PFOS的暴露强于哺乳期子鼠的暴露；而当子鼠出生时间达到5周时，哺乳期子鼠对于PFOS的暴露略强于胚胎期子鼠的暴露，说明在子鼠出生1个月后，胚胎期子鼠对于PFOS的排泄因素开始显现.由于子鼠具有对于PFOS的排泄能力，哺乳期(CT组)和胚胎期(TC组)子鼠对于PFOS的富集能力有限，染毒浓度的多少对于CT组和TC组中子鼠毛发的PFOS浓度平均值影响不大.对于TT组，染毒浓度对于子鼠毛发中检测的PFOS浓度平均值有正相关影响.TT组的子鼠对PFOS同样有一定的排泄能力，排泄能力在出生1个月后较为明显，而且对较高浓度的PFOS的排泄能力较强，PFOS暴露浓度存在一定的剂量效应关系.这些结论的深层原因待后续实验进一步研究.上述实验结论推广到以头发作为PFOS的暴露指示物分析人类婴幼儿体内PFOS暴露情况，具有可行性.
3 结论
