无菌APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠模型建立及脑内斑块变化初步观察

朱华，郭亚茜，杜晓鹏，李卓，秦川

(卫健委人类疾病比较医学重点实验室，中国医学科学院医学实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心，北京 100021)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以记忆丧失和认知减退为主要临床症状的大脑神经退行性疾病。特征性的病理学表现有：β 淀粉样肽(β amyloid peptides，Aβ)沉积形成的老年斑和tau 蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结[1-2]。目前有关AD的病因仍然不明确且临床上无有效的防治措施。随着对脑-肠-微生物菌群(brain-gut-microbiota axis，BGM)概念的提出，肠道菌群对AD的调控作用越来越受到关注[3]，但目前缺乏菌群与特定基因关系研究的动物模型。APPswe/PS1ΔE9(PAP)双转基因阿尔茨海默病小鼠模型由中国医学科学院医学实验动物研究所比较医学重点实验室构建培育。该模型以 C57BL/6J小鼠为背景，含有人APPswedish 突变位点和人PS1ΔE9突变位点。其在3月龄出现学习和记忆缺陷，4.5月龄开始出现老年斑，12月龄出现大量老年斑，具有和 AD 患者相似的病理表型。是目前常用的AD动物模型[4]。本研究采用剖宫产技术对PAP小鼠进行无菌化，并对其病理表型进行初步观察，为研究肠道菌群与AD间关系提供一种新的动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

用于繁殖的PAP阳性雄鼠和野生型C57BL/6J雌鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2014-0004】。体重(20 ± 2)g，无菌带乳ICR母鼠由本实验室繁育。动物实验在中国医学科学院医学实验动物研究所隔离设施内进行【SYXK-(京)2018-0004】。本实验中动物的使用已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会(IACUC)批准，批准号：ZH17003。

1.1.2 试剂与仪器

RIPA 裂解液购自江苏碧云天公司；十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸胺(APS)、Tris-HCl、甘氨酸、 TEMED、 Tween-20 购自美国Sigma 公司；N,N’-亚甲基双丙烯酰胺和丙烯酰胺购自美国Bio-Rad 公司；磷酸酶抑制剂购自美国 Thermo 公司；GAPDH、超敏二步法免疫组化检测试剂盒及含有 DAPI的水溶性封片剂均购自北京中杉金桥公司。使用的主要仪器有：ZHJH-C1118C型超净台、凝胶成像系统(上海天能公司)、组织脱水机、石蜡包埋机、石蜡切片机(德国Leica)、IQ5PCR仪(美国Bio-Rad 公司)。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠的准备

选择10～16周龄经检测为阳性的健康PAP雄性杂合子鼠10只，与经产的10～16周龄C57BL/6J雌鼠野生型小鼠1∶2进行交配，记录交配日期。隔离器内无菌代乳鼠提前48 h交配。每日上下午检查一次母鼠阴道口是否有阴栓。见有阴栓作为0天，开始计算孕期。已确诊受孕的母鼠与雄鼠分开单独饲养。

1.2.2 剖宫产净化

小鼠受孕17 d开始密切观察动物，当受孕小鼠食欲突然下降，烦躁不安，有作窝行为，经触诊其趾骨已打开5 mm左右，外阴潮红并处于开口状态，此时受孕小鼠已临产，可进行子宫摘除术。剖宫产手术在36～38℃环境中进行：牺牲母鼠，快速分离子宫，连同止血钳一起迅速转入装有2%过氧乙酸的渡槽，停留30 s，传入隔离器内。传入隔离器内的子宫用5% NaHCO3溶液中和子宫表面残留的过氧乙酸后摊在纱布上，用带齿镊子将子宫及羊膜撕破，取出胎仔。迅速擦去胎仔鼻和口部的羊膜及羊水。健康的仔鼠开始张口呼吸，没有呼吸的要轻轻触压胸部促其呼吸，必要时用镊子轻夹尾根，使其发出叫声，引发呼吸。开始呼吸的仔鼠将由紫红色渐渐变为鲜红色。

将呼吸正常的剖宫产仔鼠，放入代乳母鼠的原盒内。用代乳母鼠亲仔的粪便连同垫料涂抹代乳仔鼠，使失去原气味。此时留一部分亲仔共同哺乳，待母鼠接受代乳后，可除去亲仔。代乳仔鼠20～25 d离乳。

1.2.3 无菌状态维持及检测

离乳的小鼠转移至其他隔离器饲养。每个月取隔离器内饲料、垫料、饮水、小鼠粪便送卫健委实验动物质量检测中心进行无菌状态检测并出具正式报告。

1.2.4 转基因阳性动物的鉴定

子代小鼠出生9～14 d内剪趾法标记，收集剪下的组织按照文献[4]的方法进行基因型鉴定。

1.2.5 脑内斑块染色

小鼠脱颈椎处死后取左半脑固定于福尔马林溶液中24 h、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，制作厚度为5 μm横断面石蜡切片，隔3取1。切片贴到经多聚赖氨酸处理过的玻片上，按照文献[4]的方法对9月龄无菌PAP转基因阳性小鼠及同月龄SPF级小鼠海马和皮层内斑块进行免疫组化染色，观察斑块数量变化。切片光镜下观察后用 Aperio 切片扫描系统对切片进行扫描，随机截取5个高倍视野(400×)，采用 Image-Pro PLUS 图像分析系统对阳性细胞数和光密度值(IOD)进行分析。每只动物计数3张切片，取平均值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 剖宫产手术及代乳情况

用来交配的 20只母鼠中，13只观察到有阴栓，其中一例母鼠在18.5 d自然分娩，其余12例实施剖宫产手术，剖得仔鼠66只(表1)。其中有3只为死胎ICR无菌母鼠不予代乳，其余63只用母鼠成功代乳至离乳。到离乳时存活60只，剖宫产存活率和例如存活率分别为95.45%和95.24%。

表 1 PAP 小鼠剖腹宫手术及代乳情况Table 1 Caesarean section and fostering results of the PAP mice

2.2 转基因阳性动物的鉴定

部分无菌PAP小鼠基因鉴定结果见图1，携带APPswe/PS1 基因的阳性鼠可见清晰 PCR 扩增条带，与目的片段大小相符，阴性鼠无条带(图1)。剖出的阳性鼠在9月龄、12月龄安乐时可见盲肠巨大，符合无菌动物的生物学特性(图2)。

2.3 无菌状态维持及检测

按照GB/T14926.41、43-2001，GB14922.2-2011进行无菌状态检测。检测结果合格(图3)。

2.4 脑内斑块检测

9月龄无菌化PAP小鼠(图4A)及SPF级(图4B)脑内斑块含量免疫组化结果。无菌PAP小鼠海马内斑块减少，皮层内斑块数量未见显著性差异(表2)。

图1 部分PAP小鼠PCR鉴定凝胶电泳图Figure 1 PCR identification of a part of PAP mice by gel electrophoresis

图2 无菌PAP小鼠的盲肠Figure 2 Cecum of the germ-free PAP mice

图3 PAP小鼠剖宫产净化后无菌检测结果Figure 3 Pathogen test results after caesarian section in the PAP mice

组别Groups海马Hippocampus皮层Cortex阳性细胞数Number of positive cells光密度值IOD阳性细胞数Number of positive cells光密度值IOD无菌PAP小鼠Germ-free PAP mice11.32 ± 3.73*1987.64 ± 79.62*8.57 ± 2.881431.62 ± 132.113SPF级PAP小鼠SPF PAP mice17.46 ± 3.782864.37 ± 198.459.24 ± 2.621716.71 ± 159.71

注：与SPF级PAP小鼠相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the SPF PAP mice，*P< 0.05.

图4 PAP小鼠脑内斑块检测结果Figure 4 IHC staining of senile plaques in brain tissues of the PAP mice

3 讨论

无菌动物是指通过无菌剖宫产手术或无菌胚胎移植进行无菌化获得的动物，利用无菌饲养方法维持于无菌隔离器，利用现有方法检测不到活的微生物和寄生虫的动物[5]。作为微生物背景最清晰的动物，可对菌群、基因及饮食等环境因素进行有效控制，是研究肠道菌群(gut microbiota，GM)对人类疾病及健康影响的最有效动物模型之一[6-7]。遗传工程动物是研究是研究特定基因功能的重要工具，将无菌动物技术与遗传工程动物结合建立无菌化小鼠人类疾病动物模型，可揭示某种特定基因引起的表型变化与肠道菌群之间的关系，为研究肠道菌群与疾病关系提供了更多的模型选择。

无菌动物有自己的生物学特点：发育和体重增长缓慢，每窝产仔数减少[8]。PAP双转小鼠作为基因工程动物，由于基因组经过人工改造，繁殖力和免疫力都受到影响。因此与其他常规品系小鼠剖腹净化及动物相比，剖宫产及动物繁育过程中有更多需要注意的操作细节：①微生物质量控制：剖宫产净化的一个缺点是不能去除可通过胎盘垂直传播的病原体，因此在选择用来交配的转基因和野生型小鼠时就要进行严格的微生物质量控制：选用符合SPF级动物标准的PAP雄鼠和野生型雌鼠；孕鼠的交配在SPF级设施内进行；尽量避免由动物本身带来的污染。②严格无菌操作：剖宫产手术在超净台内完成，手术中严格执行无菌操作：超净台除紫外灯照射消毒外，还要用酒精擦拭台面。高压灭菌的手术器械在超净台内才能打开，保证每只孕鼠一套手术器械，连续手术时两个手术之间也要对台面进行消毒。因超净台内有气流，剖宫产手术在电热毯上进行以保证适宜温度。③剖宫产时机的选择：经产鼠的孕期较初产鼠的准确，但仍不宜以见栓后天数为主要剖宫产指征，必需结合动物的表现进行判断。实施剖宫产手术12只动物的孕期从17.5 d到21 d不等，差异很大。我们的经验是在17 d左右开始仔细观察动物，当受孕小鼠食欲突然下降，烦躁不安，有作窝行为，外阴潮红并处于开口状态，结合触诊经判断趾骨已打开5 mm左右时为最佳剖宫产时机。

本研究中由于技术人员剖宫产技术操作熟练、注重操作细节及无菌动物每窝产仔数少但成活率高生物学特性等原因，剖宫产存活率(95.45%)与离乳存活率(95.24%)均较高，但孕鼠每胎产仔数低于封闭群及单转基因小鼠剖宫产净化相关文献[9-11]，可能与双转基因动物繁殖能力降低有关。无菌动物的体重增长较缓慢，为模型小鼠后期的正常发育，我们延长了小鼠离乳的时间。经剖宫产净化的PAP小鼠脑内斑块含量发生改变，提示肠道菌群可能与斑块形成有关，相关研究正在进行中。

本研究将无菌技术应用于研究阿尔茨海默症常用的APPswe/PS1双转基因小鼠，建立了无菌化PAP小鼠模型，为研究肠道菌群与阿尔茨海默症之间的关系提供一种新的动物模型。