孕鼠强迫游泳时绝望状态与脑海马区ERα表达水平的相关性研究

王欲，夏春玲，刘彩霞

（中国医科大学 附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

孕鼠强迫游泳时绝望状态与脑海马区ERα表达水平的相关性研究

王欲，夏春玲，刘彩霞

（中国医科大学 附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

目的 观察孕鼠在强迫游泳实验（FST）中的绝望状态，检测FST后孕鼠海马区雌激素α受体（ERα）的表达，初步探讨孕鼠FST时绝望状态与海马区ERα水平的关系。方法 同批次雌昆明鼠，包括28只孕鼠和20只对照鼠；进行6次FST，记录第2次和第6次的不动时间。FST后小鼠大脑标本以海马为中心作冠状面切片，免疫组化SP法检测ERα的表达。结果 孕鼠在第 2次和第 6次 FST中不动时间（分别为 149.21± 56.10s、178.54±35.54s）均长于非孕鼠（118.80±52.72s、150.15±37.92s），P分别为0.024、0.011。孕鼠和对照雌鼠海马区均有ERα表达，但孕鼠ERα组化评分（3.86±2.69）高于非孕鼠（1.54±1.85），P为0.008。小鼠海马区ERα免疫组化评分与第2次FST、第6次FST的不动时间均有直线相关，r值分别为0.332、0.394，P值分别为0.021、0.006。结论 孕鼠在FST中比非孕鼠表现出更明显的绝望状态；其海马区ERα表达水平亦增高，可能与妊娠期抑郁有关。

抑郁症；雌激素受体α；免疫组织化学；强迫游泳实验；孕鼠

妊娠晚期孕妇面临分娩、家庭与社会角色的转变，54%的孕妇存在产前焦虑，37.1%的孕妇有产前抑郁症状［1］，妊娠 36～38周抑郁发生率为 21.6%［2］，严重影响分娩决策和母儿健康。产后抑郁已经受到医务工作者的重视，但对妊娠期抑郁的认识还很肤浅。中枢神经雌激素受体（ER）的表达与情绪、精神状态密切相关，本文通过观察孕鼠在强迫游泳实验（FST）中的行为学表现和检测FST后孕鼠海马区ERα的表达，初步探讨孕鼠情绪变化与海马区ERα水平的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

昆明鼠由中国医科大学实验动物中心提供，使用许可证号SYXK（辽）2003-0019。同批次雌鼠，体质量20～25g，随机分为妊娠组和对照组；共获得28只孕鼠和20只对照雌鼠。

1.2 实验方法

1.2.1 妊娠组合笼，行阴道分泌物涂片确定受精日期；孕鼠在受精后12d开始FST；圆柱形玻璃缸直径22cm、高25cm、盛水约15cm，水温约20℃；将小鼠放入水中，每次1只，观察6min；记录后4min小鼠在水中的不动时间，即漂浮水面、停止挣扎，仅仰露头呼吸，或偶尔扑动上肢以保持平衡，此为小鼠的绝望状态［3］；每天上、下午各进行1次，连续3d，记录第2次和第6次FST的不动时间。6次强迫游泳后小鼠处死取大脑，以海马为中心作冠状面石蜡切片。

1.2.2 免疫组织化学链霉菌抗生物素-过氧化物酶（SP）法检测小鼠大脑组织ERα的表达：一抗系Santa Cruz公司兔抗鼠 ERα（MC-20）：sc-542多克隆抗体，二抗（羊抗兔）、SP试剂、显色剂均为中杉公司分装产品；石蜡标本切片厚度5μm，一抗1∶75稀释，按照说明书步骤行免疫组化SP法染色；阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤同；每张切片在400倍光镜下随机观察5个视野，阳性判断和表达水平评分按下列标准［4］：

（1）根据染色强弱分为：阴性，核内无任何棕黄染色，0分；弱阳性，核内（伴或不伴胞浆内）浅黄染色，1分；阳性，明显黄染，2分；强阳性，棕黄或深棕色，3分；

（2）根据阳性细胞百分率分为：无阳性细胞--0分；阳性细胞百分率为1%～25%--1分；阳性细胞百分率为26%～50%--2分；阳性细胞百分率为51%～75%--3分；阳性细胞百分率为76%以上--4分；

以上两项相加作为总积分，5个视野取平均值，表示ERα的表达水平。

1.3 统计学方法：采用SPSS13.0软件；计量资料满足正态分布和方差齐性，采用两样本t检验和Pearson直线相关分析；不满足方差齐性，采用Mann-Whitney U检验。

2 实验结果

2.1 强迫游泳试验（FST）

在第2次和第6次FST中，孕鼠的不动时间（分别为 149.21± 56.10s、178.54±35.54s） 均长于非孕鼠（不动时间分别为 118.80±52.72s、150.15±37.92s），差异有统计学意义（P分别为 0.024、0.011）。孕鼠在第6次FST中的不动时间长于第2次FST，差异有统计学意义（P为0.016）。结果详见表1。

表1小鼠在FST中的不动时间（s）及海马区ERα的免疫组化评分Ta b.1Immo b i l i t y d u r a t i o n o f mi c e i n FSTa n d i mmu n o h i s t o c h e mi c a l s c o r e o f ERα i n t h e h i p p o c a mp u s Group n Immobility duration in the second FST Immobility duration in the sixth FST Immunohistochemical score of ERα Pregnant mice 28 149.21±56.10 178.54±35.541） 3.857±2.690Control mice 20 118.80±52.72 150.15±37.92 1.538±1.854 P 0.024 0.011 0.008Data are expressed asx ± s.1）P<0.05vs the immobility duration in the second FSTin pregnant mice.

2.2 免疫组化测定海马区ERα的表达

孕鼠和对照鼠海马区均有ERα表达，阳性细胞通常胞浆和胞核都被黄染，但两组染色深度以及阳性细胞分布面积都有所不同，如图A，B所示。孕鼠免疫组化评分（3.86±2.69）高于对照鼠（1.54±1.85），有极显著差异（P=0.008），提示强迫游泳后孕鼠海马区ERα表达水平高于非孕鼠。结果见表1。

2.3 小鼠在FST中的不动时间与海马区ERα水平的关系

小鼠（包括孕鼠和对照鼠）海马区ERα免疫组化评分与第2次FST、第6次FST的不动时间均呈直线相关，r值分别为 0.332、0.394，P值分别为0.021、0.006。

3 讨论

FST由法国Porsolt神经药理室发明，利用动物不能逃出恶劣环境，以致行为绝望、在水中停止挣扎而建立的评筛抑郁状态的方法［3］，这种行为绝望类似人类抑郁症［5，6］。本研究中孕鼠在FST中不动时间长于非孕鼠，表现出更明显的绝望状态，提示妊娠是抑郁症的独立风险因子。

对孕鼠进行强迫游泳尚属首次报道，构思源于对妊娠期抑郁症动物模型的寻找。预先游泳训练1次能减小实验结果的变异［7］，对不动时间变异大的小鼠尤为重要，遂取第2次FST结果作为干预前的行为学评价；经过6次强迫游泳，意在加重小鼠的行为绝望，取最后一次FST结果作为干预后的行为学评价。数次强迫游泳后的孕鼠不动时间延长，符合妊娠期抑郁症的行为学表现，可考虑作为妊娠期抑郁症的一种模型，但有待于进一步系统评价，包括与抑郁症密切相关的中枢神经递质的检测和抗抑郁药物的药理学评价。

雌激素（E）是天然的精神保护因子［8］，用于精神疾病辅助治疗的研究［9］。妊娠期高E水平应该保护孕妇远离抑郁，可事实恰恰相反，产前抑郁症发病率很高。ER广泛存在于中枢神经系统，尤其是视丘下部、海马及边缘组织中，影响情绪、学习、记忆等高级神经活动。ERβ基因敲除的小鼠，E的抗抑郁效应（降低FST不动时间）不复存在［10］；而抑郁症患者下丘脑室旁核表达促肾上腺皮质素释放激素（CRH，情绪反应的主要激素）的神经元增加且伴随ERα共区域化［11］，提示E作用于ERβ可能发挥抗抑郁作用，作用于ERα则可能抑制中枢。本研究提示FST后孕鼠海马区ERα水平高于非孕雌鼠，且小鼠在FST中的不动时间与ERα水平呈直线相关，中枢神经ERα水平增高可能正是产前抑郁的原因之一。

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［2］Gulseren L，Erol A，Gulseren S，et al.From antepartum to postpartum：a prospective study on the prevalence of peripartum depression in a semiurban Turkish community［J］.JReprod Med，2006，51（12）：955-960.

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［5］Lucki I.The forced swimming test as a model for core and component behavioral effects of antidepressant drugs.［J］.Behav Pharmacol.1997，8（6-7）：523-532.

［6］Porsolt RD，Bertin A，Blavet N，et al.Immobility induced by forced swimming in rats：effects of agents which modify central catecholamine and serotonin activity［J］.Eur JPharmacol，1979，57（2-3）：201-201

［7］张中启.国内昆明种小鼠和Wistar大鼠适合作强迫游泳抑郁模型动物［J］.中国药理学通报，2001，17（5）：592-593.

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［10］Rocha BA，Fleischer R，Schaeffer JM，et al.17Beta-estradiol-induced antidepressant-like effect in the forced swim test is absent in estrogen receptor-beta knockout（BERKO）mice ［J］.Psychopharmacology（Berl），2005，179（3）：637-643.

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（编辑 孙宪民，英文编辑 陈 姜）

Relationship between the Desperate State of Pregnant Mice in Forced Swimming Test and the Expression of Estrogen Receptor Alpha in Hippocampus

WANGYu，XIAChun-ling，LIUCai-xia
（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo observe the desperate state of pregnant mice in forced swimming test（FST）and detect the expression of estrogen receptor α（ERα）in the hippocampus of mice after swimming，and to study the relationship between the desperate state of pregnant mice in FSTand the expression of ERα in hippocampus.MethodsFemale Kunming mice of the same batch included 28pregnant mice and 20control mice.FSTwas repeated for 6times，and immobility durations in the second and the sixth FSTwere recorded.After FST，the cerebrum was sampled，and the hippocampus was the center of paraffin-embedded section.The expression of ERα was detected by immunohistochemistry.ResultsThe immobility durations in the second and the sixth FSTwere significantly longer in preganant mice than in control mice（149.21±56.10vs 118.80±52.72s，P=0.024；178.54±35.54vs 150.15±37.92s，P=0.011），respectively.ERα were expressed in the hippocampus of both pregnant mice and control mice，and the immunohistochemical score of ERα in pregnant mice was signficantly higher than that in control mice （3.86±2.69vs 1.54±2.07，P=0.008）.There were linear correlations between the immunohistochemical score and the immoblity durations in the second and sixth FST（r=0.332，P=0.021；r=0.394，P=0.006），respectively.ConclusionPregnant mice are more likely to show desperation in FST，and the up-regulated expression of ERα in the hippocampus of pregnant mice may relate to antepartum depression.

depressive disorder；estrogen receptor alpha；immunohistochemistry；forced swimming test；pregnant mouse

R714.7

A

0258-4646（2010）11-0922-03

辽宁省教育厅高校科研基金资助项目（05L458）

王欲（1981-），男，医师，博士研究生.

刘彩霞，E-mail：liucaixia@yeah.net

2010-09-07