利用正交试验优化建立大鼠条件恐惧记忆模型

郭冷秋，郭壮丽，朱霄，周蕾，王梦楠，张立光，周扬

(1. 苏州卫生职业技术学院药学院，苏州 215009； 2. 青岛大学附属医院康复医学科， 青岛 266003)

随着经济的发展和社会的进步，情绪障碍性疾病(如焦虑、失眠、创伤后应激障碍等)的发病率呈现日益增高的趋势。负性情绪(尤其是恐惧)记忆消除障碍是本类疾病发生发展的关键[1]，探讨如何有效消退由创伤经历引起的恐惧记忆、消除和降低病人的恐惧反应，具有重要的意义[2]。恐惧记忆动物模型的建立是本类疾病发病机制研究和药物研发的关键。基于巴甫洛夫条件反射原理的条件恐惧(fear conditioning)模型是目前公认的和应用最为广泛的恐惧记忆动物模型[3]。该模型将条件刺激(中性刺激，CS，如：声音)与非条件刺激(恐惧刺激，US，如：电击)进行多次匹配联结(CS-US)训练后，即使单独呈现CS 也可引发动物的恐惧反应[4]。CS-US连结训练是形成动物恐惧反应和建立恐惧记忆的关键。然而目前缺乏统一可循的标准和参考，不同的研究者往往采用不同的参数条件，导致模型的重复性和可借鉴性差，进而影响实验结果的可靠性。本研究利用正交实验设计，优选建立条件恐惧记忆模型的最佳实验参数；并对所建立的模型进行恐惧记忆保持的短期(24 h)和长期(1周、2周、4周和8周)水平检测，以考察优选条件下建立的模型的可靠性和稳定性，为相关研究提供可借鉴的实验的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组

6～8周龄清洁级SD大鼠，雄性，体重160～200 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司【SCXK(沪)2012-2002】，饲养在苏州大学实验动物中心的SPF级实验室【SYXK(苏) 2016-0049】。明暗周期为12 h/12 h(光照时间7：00～19：00)、室温22～26℃条件，自由摄食和饮水。适应7 d，期间每天由实验者抚摸大鼠3 min，并放入条件恐惧箱适应5 min，取出后用75%酒精擦拭箱体以去除遗留气味。所有操作均符合实验动物伦理学要求(伦理审批号：SWAE201902)。

分组：(1)正交试验：大鼠随机分为9组，每组7～8只，按照正交试验表L9(34)安排实验，三个因素分别为声音强度(因素A)、电击强度(因素B)和CS-US配对循环次数(因素C)，每个因素各取三个水平，因素水平见表1，9个实验组具体参数安排见表2。(2)恐惧记忆保持测试：大鼠随机分为模型组和对照组，每组9只，模型组以实验(1)所确定的试验参数进行训练，对照组不进行条件恐惧训练，其他条件同实验组。

1.1.2 仪器设备

Panlab条件恐惧与惊跳结合系统(Startle and Fear Combined System，美国Harvard公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠正常行为模式检测

实验大鼠在条件恐惧箱内适应3 min后，记录20 min内的活动情况，计算木僵反应时间占总测试时间的百分比(freezing time ratio)。连续记录3 d，取3 d的平均值进行统计分析。

1.2.2 大鼠对声音(CS)的基础反应

实验大鼠在条件恐惧箱内适应3 min后，不同组别大鼠按照正交试验设计表(见表2)分别给予相应强度的CS，每次持续10 s，共10次，间隔90～150 s(平均120 s，随机出现)。记录大鼠在CS持续时间内的freezing time ratio。

1.2.3 条件恐惧记忆模型的建立

实验大鼠在条件恐惧箱适应3 min后，按照正交试验设计表(见表2)，进行CS-US配对训练(CS持续10 s，结束之前0.5 s给予电击(US)，声音电击同时结束)，此为一个循环(trial)；此后每间隔90～150 s(平均120 s，随机出现)1个trial。统计大鼠在10个trial中的freezing time ratio。

表1 实验因素与水平Table 1 Experimental factors and levels

1.2.4 恐惧记忆表达检测

条件恐惧记忆建立24 h后，再次将大鼠放入条件恐惧箱，3 min后给予训练时的CS(不给予US)，共10次，每次持续10 s，间隔时间为120 s。统计大鼠在CS持续时间内的freezing time ratio。对实验结果进行直观分析和方差分析，明确影响恐惧记忆形成的因素主次，确定最优试验条件。

1.2.5 恐惧记忆保持检测

利用上述实验确定的最优试验条件，建立大鼠恐惧记忆模型，并对大鼠进行短时(24 h)和长时(1周、2周、4周和8周)恐惧记忆的保持检测。方法同1.2.4。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠正常活动模式

各组大鼠在条件恐惧建立前正常活动的freezing time ratio见图1，单因素方差分析结果表明，各组之间差异无显著性(P=0.9996，F=0.07885)。

图1 各组大鼠正常活动时木僵反应时间百分比Figure 1 Freezing time ratio of the rats in each group during normal activities

2.2 大鼠对CS的基础反应

各组大鼠在CS持续时间内freezing time ratio见图2，单因素方差分析结果表明，各组之间差异无显著性(P=0.9998，F=0.06774)。

图2 各组大鼠对CS的基础反应Figure 2 Basic response of the rats to CS in each group

2.3 恐惧记忆的表达

条件恐惧记忆建立后24 h各组大鼠freezing time ratio见表2。比较各因素的极差R，发现各因素影响能力排序为A=C>B。其中5号实验(A2B2C3)结果最好，木僵时间达到82%，故建立大鼠条件恐惧模型最佳条件为A2B2C3，即声音75 dB，电击强度0.8 mA，循环15次；方差分析结果(表3)表明，因素C对实验结果有显著影响(P< 0.05)，因素A，B对实验结果影响不显著(P> 0.05)。因此C为主要因素，A、B为次要因素。按照方差分析观点，只需对有显著影响的因素选择最佳水平，而其他对试验结果影响较小的因素，可按实际需要选择适当的水平。因此实验中最优条件是A2B2C3，与直观分析结果一致。

2.4 恐惧记忆的保持

利用优化后的实验参数建立条件恐惧记忆模型，在建模后的第24 h和1周时，模型组大鼠freezing time ratio与对照组比较差异具有显著性(P< 0.001和P< 0.05)。第2周后，恐惧记忆逐渐消退，与对照组比较差异无显著性(P> 0.05)。实验结果见图3。

表2 正交试验设计及直观分析结果Table 2 Design of the orthogonal test and results of intuitive analysis

表3 方差分析结果Table 3 Results of variance analysis

注：恐惧记忆建立后不同时间点检测，与对照组比较，*P< 0.05，***P< 0.001。图3 恐惧记忆保持测试结果Note. Compared with the control group at different times after fear memories built up, *P< 0.05, ***P< 0.001.Figure 3 Results of the fear memory retention test

3 讨论

建立具有较好的稳定性和可重复性的动物模型是研究疾病发病机制和治疗药物的前提和基础。基于巴普洛夫条件反射原理的条件恐惧记忆动物模型，广泛用于恐惧症、PTSD等恐惧相关性疾病的研究[5]。然而模型建立的成功与否受到诸多因素的影响，如电击(US)的强度、声音刺激(CS)强度及CS-US配对训练次数等。成功的模型以既能引起动物产生明确的恐惧反应，且又不对动物造成生理性的伤害为目标[6]。目前各研究室采用的实验条件不尽相同，虽然都能在一定程度上反映动物的恐惧记忆，但是不同条件建立的模型的稳定性和持续性往往存在差异，因而难以保证实验结果的一致性和可靠性。宋海滨等[7]曾比较和评价了KM和C57BL/6小鼠在用不同电击强度进行训练时恐惧性记忆建立的差异；郭呈斌等[8]报道了足底电击诱导树鼩条件恐惧记忆模型的建立及抹除方法。但目前关于大鼠恐惧记忆建立的方法学评价，尚未见报道。本研究在文献研究的基础上[9-12]，利用正交试验，考察和评价了电击(US)强度、声音(CS)强度和CS-US配对训练次数3个因素在3个不同水平上对实验结果影响的。正交试验直观分析表明，各因素影响能力依次为声音强度=循环次数>电击强度(表2)；方差分析表明，循环次数对实验结果有显著性影响(P< 0.05)，声音强度和电击强度影响不显著(P> 0.05)(表3)。因此确定最优实验条件为：声音75 dB，电击强度0.8 mA，CS-US配对循环训练15次。模型稳定性测试结果表明，大鼠在1周内恐惧记忆保持良好，与对照组比较差异显著；2周后，恐惧记忆逐渐消退，与对照组比较差异不显著(图3)。

因CS-US配对训练次数是影响实验结果的显著因素，提示我们，若要建立稳定表达的恐惧记忆动物模型，可以适当增加训练的次数或训练周期。表3可见，电击强度为1 mA时freezing time ratio最高为77%，而0.8 mA的结果为82%，提示并非电击强度越大恐惧记忆表达越好，这种现象可能反映了应激反应的程度对记忆固化过程的影响，此结果与Anagnostaras等[13]的研究一致。此外，模型建立前我们还检测了大鼠正常的活动模式以及对CS的基础恐惧反应，考察模型的可靠性。结果可见，大鼠在条件恐惧建立后的freezing time ratio(表2)与正常活动模式(图1)相比较有明显提高；大鼠对CS的基础反应(图2)与正常活动模式(图1)比，无明显变化。这些结果表明，CS-US配对训练后freezing time ratio的增加并非是对声音的恐惧所导致的，而是条件恐惧记忆建立的结果。

综上所述，本研究明确了建立大鼠条件恐惧记忆模型影响因素的主次，优化了实验条件，并考察和评价了模型的稳定性和可靠性，为条件恐惧记忆模型的标准化、规范化及后续研究提供了可借鉴的实验依据。