一株高产春雷霉素菌株生长特性及其培养基优化

梁剑光 祝金山 赵明霞 栗波 王立梅

(1 常州大学制药与生命科学学院，常州 213164；2 常熟理工学院生物与食品工程学院，常熟 215500；3 浙江钱江生物化学股份有限公司，海宁 314400；4 苏州大学药学院，苏州 215123)

春雷霉素，又称春日霉素，商品名称为加收米，是由肌醇和二基已糖组成的双糖类物质，其化学分子式为C14H25N3O9(图1)，呈弱碱性[1]。春雷霉素由小金色链霉菌(Streptomyces microaureus)在发酵过程中分泌产生，在农用和医疗上都具有重要作用，可用于防治革兰阴性菌和革兰阳性菌的感染，医疗上对铜绿假单胞菌的感染治疗上有极好的效果[2]；春雷霉素农业上作农用杀菌剂，对稻瘟病具有突出的防效和治疗作用，并对人畜毒性较低，对环境亦无污染作用[3]。目前国内生产厂家较少[4]，其原料主要由延边春雷生物药业有限公司生产，因此，提高春雷霉素菌株的高产特性具有重要现实意义。

图1 春雷霉素分子结构[1]Fig.1 Structures of kasugamycin

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试验菌株

CIT-04菌株由常熟理工学院梁剑光老师实验室提供。

1.1.2 主要培养基

(1)种子培养基(%)：黄豆饼粉1.5，食用豆油1，KH2PO40.08，NaCl 0.3，蚕蛹粉0.1，玉米浆0.1，酵母膏0.3，甘油0.6，pH6.7～6.8。(2)初始发酵培养基(%)：黄豆饼粉 3，食用豆油2，KH2PO40.05，NaCl 0.3，蛋白胨0.3，麦芽糖2，pH6.6～6.7。

1.1.3 主要仪器设备与试剂

恒温培养摇床购于上海世平实验设备有限公司；细菌培养箱购于上海申贤恒温设备厂；低温离心机(H-2050R)购于长沙湘仪离心机仪器有限公司制造；麦芽糖、葡萄糖、碳酸钙、酵母粉、春雷霉素标准品等试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 春雷霉素标准曲线制作

标准品春雷霉素2.0%的水剂为2mg/kg，即相当于2万单位，将标准品稀释成不同的浓度，采用管碟法测定春雷霉素标准品效价，作出标准曲线方程。

1.2.2 高产菌株的种子制备

用250mL锥形瓶，装液量30mL，灭菌后在超净台上挑取大小约为0.5cm×0.5cm菌块，接入种子培养基中，于28℃旋转式摇床(240r/min)培养30～36h，菌浓(pacted mycelium volume,PMV)达到15%～20%再接入发酵瓶中。

1.2.3 菌浓(PMV)的测定

取10mL菌液注入10mL有盖离心管内，于冷冻离心机中离心10min(离心转速10000r/min)，再计算压缩体积与总液体体积比。

1.2.4 春雷霉素菌株摇瓶发酵

取250mL锥形瓶，每瓶装液量为30mL，灭菌后在超净台上从种子液中取4.0mL接入发酵瓶中，于28℃旋转式摇床(240～260r/min，湿度45%～49%)培养168～192h，检测发酵过程中的春雷霉素效价。

1.2.5 春雷霉素效价测定(管碟法)

春雷霉素发酵后经过离心，取上清液，将牛津杯至于含枯草芽孢指示菌的双层固体平板上，牛津杯放置应尽量保持间距相等，每个牛津杯加入200μL发酵处理后的上清液(发酵液稀释一定倍数)，将平板放于4℃冰箱1h左右，便于抗菌素扩散。随后，再移入37℃培养箱中培养30h，取出测量抑菌圈大小，利用标准曲线方程计算效价。

2 结果与分析

2.1 春雷霉素标准品曲线与效价关系

本实验设计7个浓度梯度，分别是500、750、1000、1250、1500、1750和2000U/mL。采用双层平板(牛津杯法)测定标准品的抑菌圈。主要结果见图2，通过线性拟合，得出春雷霉素标准品抑菌圈直径与效价关系方程：y=0.74x+1.77(R=0.9996)，见图3，数据拟合良好。

2.2 高产菌株CIT-04菌体形态特征与菌体浓度关系

实验设计12组春雷霉素菌株CIT-04种子液，每组3瓶，每隔3h测1次菌浓，结果见表1。从表1可以看出，菌浓PMV在12h之前仅增加1.0%，比较缓慢，但从12h之后，菌浓开始快速增加，而在33h后，菌浓达到25%，36h稍有下降趋势。这说明，种子摇瓶摇床培养较为适合的时间点在第33小时左右，这时根据菌形和菌浓初步判断为该菌种的最佳接种时间。

从种子镜检图4中可以看出，培养24h种子液的菌体含量较少，菌体形态与细菌类非常相似，正处于分裂之中，有的呈弯曲或弧形状。培养30和33h种子液的菌体在镜检视野中数量明显增多，且短杆菌状增多，这与一般放线菌的形态有较大差别。

图2 春雷霉素标准品抑菌圈效果Fig.2 The inhibitory zone of kasugamycin standard substance

图3 春雷霉素效价的标准品曲线Fig.3 Standard titer curve of kasugamycin

表1 种子培养基中菌株CIT-04菌体浓度(PMV)变化情况Tab.1 PMV of strain CIT-04 cultured at seed stage

图4 春雷霉素菌株CIT-04在种子培养中培养时间与菌形变化Fig.4 Pellets morphology of strain CIT-04 grown at seed stage

2.3 春雷霉素菌株CIT-04发酵培养基成分单因素实验

2.3.1 发酵培养基中复合碳源对发酵的影响

首先根据文献查阅资料，分别采用麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇进行糖类发酵实验，基础发酵培养基中其他成分不变。第7天测定春雷霉素菌株的发酵效价，结果如表2所示：以麦芽糖作为糖类发酵结果效价最高，其次是蔗糖，葡萄糖最低。因此，麦芽糖是比较适合作为春雷霉素发酵的碳源，与文献报道基本一致。

在此实验基础上，以麦芽糖为基础碳源，再选择食用豆油、玉米油和菜油与麦芽糖组合作为春雷霉素发酵培养基中的复合碳源，在第7天对菌株发酵效价进行测定，结果如表3所示。食用豆油作为与麦芽糖搭配为复合碳源，菌株具有较高的发酵效价，其次是玉米油，综合考虑成本等因素，食用豆油是作为较好的一种碳源。

2.3.2 发酵培养基中几种有机氮源对发酵效价的影响

选用黄豆饼粉、花生饼粉和豆粕粉作为氮源，分别配制发酵培养基进行发酵效价测定，结果如表4。

表2 不同碳源(糖类)对应春雷霉素效价影响Tab.2 Titers of kasugamycin produced by CIT-04 grown on different carbon sources

表3 不同油类碳源所对应的春雷霉素效价Tab.3 Titers of kasugamycin produced by CIT-04 grown on different oil sources

因此，黄豆饼粉效果最好，花生饼粉也有明显效果，而豆粕粉的效果较差。因而，有机氮源选择黄豆饼粉较为合适。

2.3.3 发酵培养基中添加Mg2+对效价的影响

在发酵培养基配方添加Ca2+(以CaCl2计)、Mg2+(以MgSO4计)比较发酵效果，其中有一组不添加任何离子作为对照组。实验结果如表5。

由表5结果可知，Mg2+的促进作用是很明显的，Ca2+的添加没有明显影响，从而，可以选择在发酵培养基中选择添加Mg2+从而获得更高的发酵效价。

2.3.4 正交设计实验优化发酵培养基

上述筛选出的几种因素：麦芽糖、黄豆饼粉、食用豆油、Mg2+进行正交试验设计L9(34)。正交实验分析如表6所示。

从表7可以看出，极差由大到小排列为：黄豆饼粉＞食用豆油＞麦芽糖＞Mg2+，这说明黄豆饼粉的影响最大，其次分别是食用豆油、麦芽糖、Mg2+。因此，本实验筛选出的最佳发酵配方为：黄豆饼粉4%、食用豆油2.5%、KH2PO40.05%、玉米浆0.1%、NaCl 0.5%、鱼粉蛋白胨0.5%、麦芽糖3.0%、蚕蛹粉1.0%、MgSO40.03%。通过摇瓶实验验证后，菌株CIT-04发酵效价达到18780U/mL。

表4 不同有机氮源对应春雷霉素效价Tab.4 Titers of kasugamycin produced by CIT-04 grown on different nitrogen sources

表5 添加金属离子对春雷霉素的效价影响Tab.5 Effect of metal ions on kasugamycin titer

表6 L9(34)正交试验表头设计Tab.6 The orthogonal experimental design [L9(34)]

3 结论与展望

本文主要对高产菌株CIT-04产春雷霉素种子菌体形态和发酵培养基进行优化研究，通过本实验最终得出如下结论：种子培养33h菌浓(PMV)达25%接种时机最佳；通过对其发酵培养基成分单因素筛选和正交优化试验，确定培养基配方为：黄豆饼粉4%、食用豆油2.5%、KH2PO40.05%、玉米浆0.1%、NaCl 0.5%、蛋白胨0.5%、麦芽糖3%、蚕蛹粉1%、MgSO40.03%，最终高产菌株春雷霉素发酵效价可达到18780U/mL。

表7 正交设计实验结果Tab.7 The result of orthogonal experimental [L9(34)]

春雷霉素作为农用杀菌剂以其高效、低毒、低污染而得到广大用户的喜爱[5-6]。然而，春雷霉素目前国内生产厂家较少，其菌株和工艺有待进一步提升[7]。展望未来，春雷霉素生物合成和基因功能研究已逐渐清晰[8-9]，但产业化和应用推广上还有待扩展，比如春雷霉素对铜绿假单胞菌的感染治疗效果突出，希望能进一步开发成为一种新药投入市场，使患者受益。目前春雷霉素医药价值还未开发，春雷霉素也能有望在医药学上大放光彩。总之，今后对春雷霉素生产工艺而言，进一步选育高产的菌株依然是今后提高产量的关键手段，其次是拓展其应用范围，开发更有价值的春雷霉素衍生物。