大鼠坐骨神经离断后细胞增殖、迁移与凋亡在近远端神经片段的表达研究

姜 南，张志雄，李俊莹，刘天戟

(吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033)

周围神经损伤所后，预后常不理想，肢体会留存不同程度的功能障碍，患者的身心受到莫大伤害，同时也给社会增加了沉重的负担[1]。目前，各种新型的人工生物组织神经也已应用于临床，但效果仍不能取代自体神经移植。究其原因，是由于周围神经损伤后病理生理变化受诸多因素影响，且在损伤神经的近端和远端会呈现不同的变化。远端细胞会发生程序性凋亡，进而神经出现退行性变；近端神经组织的抗凋亡信号会比较明显，促进沿损伤的轴突再生[2]。神经损伤后再生速度缓慢，近远端具体变化的时间节点以及参与的主要调控因子，尚不完全明确，这些都对我们临床工作中促进神经功能恢复有着莫大的影响[3]。本研究设计了大鼠坐骨神经离断的模型，利用基因芯片技术对其近远端基因所反映的细胞增殖、迁移和凋亡的变化趋势进行分析并加以对比，已期能找到疾病发生发展和转归时期中的关键点，从而为临床提供高效的治疗方案。

1 材料与方法

1.1 实验动物造模及取材

健康成年SPF级SD雄性大鼠，体重200±20 g，80只(10只备用)，进行腹腔注射麻醉，采用复合麻醉剂(戊巴比妥钠30 mg/kg)。麻醉生效后，无菌操作暴露右臀部，取纵行切口，分离臀大肌后，暴露坐骨神经臀部走行长约1 cm，于梨状肌下缘行神经横断，两侧均简单处理防止神经再生自行接触。无菌化处置创口后，大鼠饲养于24-30摄氏度，30-50%湿度的笼箱中，饮水及摄食自由，保证足够时间光照。对照组不做任何处理。

取材：于拟定的每个时间点:术后0天(即刻)，1天，3天，6天，9天，12天，15天各取大鼠10只，沿原切口分离进入，取近端及远端神经组织各0.3 cm，液氮冻存，以留实验用。

1.2 RNA提取和基因芯片分析

将取材所得的大骨坐骨神经片段用于制备基因芯片，为减少异质化，分析重复3次。

基因芯片制备：提取RNA并沉淀，测定RNA序列，分别合成第一链与第二链cDNA，并纯化，用生物素标记合成的cRNA，行纯化并体外转录得到产物，分光光度计测定cRNA浓度，凝胶电泳检测，然后片断化cRNA，行分子探针杂交，洗脱和染色，最后得到基因数据。

基因筛选：根据每个时间点不同的基因比率，使用昂飞基因差异分析扫描系统进行分析，对长、短时间不同序列下的差异基因分别进行表达趋势的显著性分析，差异性表达基因的筛选依据为P<0.05，fold change>2，得到整体差异基因的数量。

1.3 生物学进程分析

我们应用DAVID生物信息数据库对已经筛选出来的差异基因进行分析，通过Gene Ontology (GO)进行进一步筛选。根据已知的周围神经损伤后再生的病理生理学特点，我们选出了细胞增殖、细胞迁移、细胞凋亡这3个生物学进程有关作为关键词，对筛选基因的Entrez Gene ID号进行分类分析，找到与之相对应的基因，得到其在不同时间点的变化过程。

1.4 实时定量PCR(Real-time PCR)分析

先行设计引物序列，利用不同时间点取材的神经片段行总RNA的制备，逆转录反应扩增，96wells Real-time PCR检测。 为减少实验误差，我们选取了内参GAPDH对所有的目的基因进行校正，在重复3次的基础上，再进行δ配比进行相对定量分析。在每个拟定的时间点，所筛选基因的表达水平与0天(即刻)进行对比分析。本实验所得数据采用SPSS21.0 软件统计进行单因素方差分析处理，当P<0.05时认为基因差异性有统计学意义。

我们选取四个与细胞增殖、细胞迁移、细胞凋亡这3个生物学进程的特异基因进行验证，即Areg、Gdnf、Shh、Mal。双调蛋白(Areg，Amphiregulin)是表皮生长因子(EGF)家族成员之一，在细胞的增殖，侵袭，转移，神经血管形成中发挥重要作用[4]。胶质细胞源性神经营养因子(Gdnf，glialcellline-derived neurotrophicfactor)一种神经营养因子，在生理功能、受体、信号传导途径等方面有着重要的作用[5]。音猬因子(Shh，Sonic Hedgehog)是重要的信号转导因子，指导核内因子转录，起到调节细胞增殖代谢的作用[6]。Mal基因的作用是编码髓磷脂和淋巴细胞蛋白，其失活及异常与细胞信号转导、异型细胞的增殖凋亡等有一定关系[7]。

2 结果

2.1 基因芯片结果

从差异基因表达的数量可以看出，在近侧端神经片段，细胞增殖、细胞迁移、细胞凋亡随着实验时间的推移，差异基因的表达数量逐渐增高，在第6天和第9天之间达到高峰，即达到了神经调控的高表达平台；然后差异基因的表达数量逐渐下降，但仍处在一个相对较高的数量级，三者的整体趋势基本一致(表1，图1)。在远端神经片段，细胞增殖、细胞迁移随着时间的推移，差异基因的表达数量也是逐渐增高的，并且在第9天达到高峰，后呈下降趋势，而细胞凋亡则全程表达逐渐增高，直到实验的终点第15天至最高峰。远端神经片段差异基因表达的数量较近端占优势，尤其以细胞增殖和细胞凋亡为主(表1，图2)。

2.2 实时定量PCR结果

我们筛选了四个与细胞增殖、细胞迁移、细胞凋亡这3个生物学进程相关的特异基因进行验证，由实验结果可以看出，Areg、Gdnf、Shh、Mal这四个典型的细胞因子的基因芯片表达趋势与分子生物学验证的RNA表达趋势基本一致(表2，图3和4)。

表1 近端与远端神经片段差异基因的表达数量

图1 近端神经片段差异基因数量柱状图

图2 远端神经片段差异基因数量柱状图

表2 近端与远端相关差异基因表达值

图3 近端相关基因的RNA表达

图4 远端相关基因的RNA表达

3 讨论

神经发生损伤后，巨噬细胞会吞噬损伤细胞崩解成的碎片，为神经再生创造合适的微环境，而雪旺细胞会发生分化并进一步增殖以形成Bünger带，其他分化形成的神经细胞会沿着其生长形成新的神经束。有学者研究发现，神经损伤后，位于不同位置雪旺细胞都会有不同表型的变化，在近端区域，随着Bünger带的形成，成熟的雪旺细胞会发生增殖和迁移，并附着于其上，结构还未完全稳定时，即向远端区域靶向生长移动，新生者并已有了神经的相关结构和功能[8]。

在本研究中，近端神经片段细胞增殖的差异基因数量呈升高趋势，并在第6天到第9天达到顶峰，后略有下降。远侧端差异基因的趋势与其对应相似，但整体数量较其明显增多。从此可以看出，无论在近远端哪方面，细胞增殖都是一个高表达的因子系列，说明其贯穿于整个神经再生修复的始终。而在这里面，与雪旺细胞转化增殖相关的基因在调控方面起到了主导作用[9]。

细胞迁移在整体趋势方面，与细胞增殖近似。近端差异基因的数量逐渐增多，并在第6天至第9天达到达峰值，后开始下降；在远端方面，高峰同样出现在第9天，而后呈下降趋势。细胞迁移是生命体发育和维持稳态的重要环节，无论是正常增殖，异常创伤等造成的组织正常或异常形成，以及免疫趋化反应，均需要特定细胞在特定信号因子的刺激介导下，朝特定部位定向移动，且过程被精细调控[10]。神经损伤后，对细胞迁移有调控功能的基因数量及表达水平在短期内迅速增多，考虑它们可以在识别损伤信号后，调控中性粒细胞、单核巨噬细胞等向损伤的部位迅速迁移，介导相关的炎症与免疫反应。在后期阶段，一些特定介导细胞吞噬功能的基因除了参与细胞迁移，可同时清除细胞碎片，并在轴突导向生长等方面起到协同的作用[11]。整体上来看，细胞迁移与细胞增殖的趋势基本相同。不同在于早期阶段，远侧端细胞迁移表达较弱，说明其早期刺激细胞迁移较弱，而分化吞噬作用起主导地位，为再生建立合适的内环境，而后维持动态平衡[12]。

在细胞凋亡方面，近侧端差异基因呈显著升高趋势，在第6天至第9天维持相对高水平。与近侧端结果不同，远侧端差异基因在整个实验过程中呈高表达状态，并持续上升，在实验的最终日期15天达到最高。周围神经损伤后，远端组织会发生程序性退行性变，与此同时，损伤局部的抗凋亡信号会被激活。这种反馈性的保护作用在近远端程度不同，近端较明显，而远端则凋亡信号占优势，炎性细胞浸润与吞噬细胞清除碎片比较明显，组织会发生全长溃变[13]。

实验结果说明，在神经损伤后，大量的炎症细胞和免疫细胞在趋化作用下迁移到损伤局部，进一步通过增殖作用以维持相关反应的进行。在这些作用下，增殖和凋亡这两个相反的过程既相互对抗，又互相联动，达到了一个相对的平衡状态[14]。远侧端神经凋亡基因随时间呈持续高表达，到达实验最远的时间两周，说明神经损伤后远侧端失去了近侧端的支配调控，已不能保持相对的平衡，凋亡占绝对优势，这也阐明了Wallerian变性的真实特点[15]。

周围神经损伤后近远端会呈现不同趋势的变化，这是由不同的细胞因子来调控的，它们互相关联，组成了一个动态发展的网络。通过本研究，我们希望在周围神经损伤后再生分子调控的机制上，可以通过基因水平的深入研究，找到其网络调控的关键位点，以便为临床工作带来新的契机。