成骨细胞条件性FKBP8基因敲除小鼠模型构建

王 红，孙 鹏，王 岩，张武锔，张 晟*

(1.南方医科大学附属第三医院，广东 广州510630；2.广东省骨科研究院，广东 广州510630; 3.广东省骨科医院，广东 广州510630；4.中山大学肿瘤防治中心麻醉科，广东 广州510060; 5.华南肿瘤学国家重点实验室广东 广州510060；6.肿瘤医学省部共建协同创新中心，广东 广州510060; 7.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130000；8.南方医科大学基础医学院细胞生物教研室，广东 广州510515)

FKBP8是膜伴侣，其主要定位于线粒体并含有COOH末端。FKBP8与其他FKBP家族成员的不同之处在于该活性依赖与钙调蛋白的结合。FKBP8通过将抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL募集到线粒体来抑制细胞凋亡[1]。FKBP38缺陷的小鼠在出生后不久死亡，表现出神经管闭合的缺陷，其部分原因是无限制的细胞凋亡[2]。FKBP8在线粒体自噬过程中，Bcl-2从线粒体转移到内质网，这是一种自噬形式，负责消除受损的线粒体[3]。FKBP8在许多方面是FK506结合蛋白的特殊成员。除了在程序性细胞死亡中的这种作用之外，FKBP8似乎涉及非常不同的细胞过程，其不一定依赖于FKBP结构域。这些功能涉及激酶mTOR的调节[4]，神经管形成的调节，细胞缺氧反应的调节，以及丙型肝炎病毒复制[1,5,6]。因此，FKBP8可能与细胞凋亡导致的体内退行性病变骨质疏松症有关。

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是以骨质量丢失、骨组织微观结构退变致使骨脆性增加并易于发生骨折为特征的代谢性骨病[7]。目前，我国有近1亿骨质疏松症患者，居世界首位。由于骨质疏松引起的各种脆性骨折是导致老年人病残和死亡的重要原因，骨质疏松症已经成为严重危害公众健康的社会问题。现阶段对骨质疏松的药物治疗主要是钙剂、维生素D和骨吸收抑制药(包括雌激素、选择性雌激素受体调节剂、双膦酸盐等) 等三大类药[8]。

目前认为，破骨细胞(osteoclast,OC)的骨吸收和成骨细胞(osteoblast,OB)的骨形成作用间的动态平衡和偶联是维持正常的骨生理功能和骨量的基础，许多激素、细胞因子、生长因子相互联系，相互制约，控制骨代谢水平和破骨/成骨活性的平衡。由于衰老、雌激素缺乏或药物等因素造成这种平衡的破坏使骨吸收超过骨形成，从而引起骨丢失与骨质疏松[9]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 BGLAP-Cre小鼠 (019509 B6N.FVB-Tg(BGLAP-Cre)1Clem/J)购自Jackson Laboratory(美国),FKBP8f/f小鼠由赵子健教授实验室赠送。野生型C57BL/6小鼠购自南方医科大学实验动物中心。实验方案得到南方医科大学实验动物使用管理委员会批准。

1.1.2试剂 鼠尾基因组裂解液：A液(500 mM EDTA、100 mM NaOH、pH8.0)，B 液(1M Tris-HCL、PH8.8)均为南方医科大学细胞生物学实验室配制；琼脂糖(TSJ001)、EB替代物(TSJ002)购自北京擎科新业生物技术有限公司；PCR引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成； FKBP8抗体购自Thermo Scientific公司；全蛋白提取试剂盒(KGP2100)、凯基生物 BCA蛋白含量检测试剂盒(KGP902)购自江苏凯基生物技术股份有限公司；5%牛血清白蛋白购自Sigma(美国)；PVDF膜购自Millipore公司(美国)。

1.2 方法

1.2.1小鼠的饲养与繁殖 小鼠饲养在SPF级、温度22-25℃、湿度55%-60%动物房。使用啮齿类动物繁殖饲料进行饲养。BGLAP-Cre小鼠引进后采用BGLAP-Cre阳性小鼠与野生型小鼠(C57BL/6)交配繁殖；FKBP8loxp/loxp小鼠引进后与野生型小鼠(C57BL/6)交配获得杂合子后代、后续采用雌雄均为杂合子进行交配繁殖保种。

1.2.2成骨细胞条件性敲除FKBP8基因敲除小鼠的构建 将BGLAP-Cre小鼠与FKBP8loxp/loxp交配，繁殖出BGLAP-Cre/FKBP8loxp/+F1代小鼠,由F1 代BGLAP-Cre/FKBP8loxp/+和FKBP8loxp/loxp交配，得到BGLAP-Cre/FKBP8loxp/loxp小鼠。

1.2.3基因型鉴定 小鼠基因组DNA提取：剪取小鼠鼠尾，碱裂解法提取小鼠DNA。鼠尾DNA样品作为模板进行PCR扩增，设计目的基因上下游引物，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带进行结果鉴定。PCR反应体系：PCR-Mix 10 μl、引物F 1 μl、引物R 1 μl、2 μl模板、6 μl ddH2O，共20 μl。引物序列见表1。

表1 基因鉴定引物

1.2.4小鼠敲除效果验证 选择同窝同性别CKO小鼠和BGLAP-Cre阴性小鼠。用全蛋白提取试剂盒提取小鼠原代成骨细胞总蛋白，进行蛋白定量，对FKBP8表达水平进行Western blot检测。

2 结果

2.1 BGLAP-Cre、FKBP8flox/flox和BGLAP-Cre(FKBP8flox/flox)小鼠基因型鉴定

BGLAP-Cre小鼠和野生型小鼠(C57BL/6)交配繁殖，获得BGLAP-Cre 表达阳性的小鼠，BGLAP-Cre小鼠基因型鉴定结果如图1；FKBP8小鼠雌性杂合子与雄性杂合子交配繁殖，鉴定flox位点，子代小鼠基因型鉴定结果如图2；将基因型为BGLAP-Cre(FKBP8f/+)F1代小鼠与基因型为FKBP8f/f小鼠交配，获得F2代小鼠，其中基因型为BGLAP-Cre(FKBP8f/f)即为条件性敲除小鼠，如图3。

2.2 FKBP8基因敲除效果

选择F2代KO小鼠，提取KO小鼠和CON小鼠原代成骨细胞蛋白，以β-actin蛋白作为内参，进行Western blot检测。图4结果所示， FKBP8 基因在成骨细胞的表达基本不表达，蛋白分析结果表明FKBP8 基因已经在成骨细胞中被敲除。

注：样品3、6、7为单一亮带，为表达BGLAP-Cre重组酶阳性小鼠；1、2、4、5、8无条带，为BGLAP-Cre重组酶阴性小鼠；样品M为Marker

图1 BGLAP-Cre小鼠基因鉴定结果图

注：样品3、4、8为FKBP8纯合子小鼠(FKBP8flox/flox)，可见272 bp 单一亮带；样品1、2、5、7为野生型b6小鼠，可见单一217 bp 亮带；样品6为杂合子；样品M为Marker。

图2 FKBP8小鼠基因鉴定结果图

注：样品7为FKBP8 纯合子表达BGLAP-Cre阳性小鼠(FKBP8flox/flox;BGLAP-Cre)；样品2、3、4、5、6为FKBP8杂合子表达BGLAP-Cre阳性小鼠(FKBP8flox/-;BGLAP-Cre)；样品1为FKBP8 杂合子表达BGLAP-Cre阴性小鼠(FKBP8+/-)；样品8为BGLAP-Cre阳性小鼠。

图3 BGLAP-Cre(FKBP8flox/flox)基因型鉴定结果图

图4 Western blot验证FKBP8基因敲除效果

3 讨论

本研究构建成骨细胞条件性敲除FKBP8基因小鼠，为阐明FKBP8在骨质疏松症的作用提供小鼠动物模型。本研究通过Western blot验证小鼠敲除效果 KO组与对照组FKBP8蛋白表达量差异明显，敲除效果明显。

骨质疏松症(OP)是一种常见疾病，其特征在于骨质量和微结构的系统性损伤，导致脆性骨折[10]。据估计，到2025年，仅美国骨质疏松症引起的骨折发病率就高达每年300万例[11]。目前，骨质疏松症已成为影响人们生活质量的流行病之一，因其在全世界的病因多样，病因复杂。在临床实践中，大多数骨质疏松症患者是绝经后的老年女性，发现年龄相关性同时对骨质疏松症的发病机制起作用[10,12,13]。

FKBP8近来研究表明与体内细胞凋亡进行相关，FKBP8心脏条件性敲除小鼠与野生型小鼠抗心衰能力不同[2]，说明FKBP8基因在特定组织的作用尚不能确定。本研究采用成骨细胞特异性Cre重组酶小鼠，构建出成骨细胞特异性敲除FKBP8基因小鼠，为研究FKBP8在成骨细胞发育过程及骨质疏松症发病中的作用机理。进一步为骨质疏松症的治疗靶点寻找提供动物模型。