流式荧光发光法联合检测肺癌患者血清CEA、CYFRA21-1、CA125及NSE的性能评价

赵 虹,纪秋野，王博扬

(吉林大学中日联谊医院,吉林 长春130033)

肺癌已经成为一种常见的癌症类型，并被确定为中国癌症死亡的主要原因[1]，其发生、发展是一个多因素、多阶段过程，伴随着诸多分子及细胞生物学改变。有一系列的肿瘤标志物在肺癌的发生及发展过程中起到至关重要的作用，并且其在肺癌的诊断和后续治疗监测中也显得尤为重要[2]。例如神经元特异性烯醇化酶(NSE)，即是小细胞肺癌(SCLC)患者的一种可靠的肿瘤标志物[3],而癌胚抗原(CEA)、癌胚抗原125(CA125)及细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)则被广泛的应用于非小细胞肺癌(NSCLC)的研究中，而且CYFRA21-1的敏感性最强[4-9]。因此，选择一种合理的肿瘤标志物的检测方法，在癌症患者疾病分型及后期用药疗效观察方面均起到了至关重要的作用。目前常用的肿瘤标志物检测方法主要有放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、电化学发光法( ECLIA)等。本实验采取的流式荧光发光法是一种基于荧光编码微球和流式技术相结合的高通量发光检测技术，对CEA、CA125、CYFRA21-1及NSE的血清表达水平进行检测，并对检测方法的准确性等方面其进行分析和评估。

1 材料与方法

1.1 检测标本

选择2018年3月至2018 年8月末，吉林大学中日联谊医院门诊和住院的患者40例，用含分离胶和促凝剂的真空采血管采集各研究对象的空腹静脉血3 mL，室温静置，3 500 r /min离心5 min，分离血清待检。弃去溶血、脂血标本。本研究经医院医学伦理学委员会批准且患者知情同意。

1.2 试剂与仪器

多肿瘤标志物检测试剂盒(上海透景生命科技有限公司)，罗氏试剂盒(瑞士罗氏公司提供)、所用校准品、质控品均为各试剂盒原装配套；Luminex多功能流式点阵仪(美国Luminex公司)、全自动流式荧光发光免疫分析仪(Tesmi F3999)罗氏电化学发光法检测仪(Cobas e411Roche 公司，瑞士))、台式低俗自动平衡离心机(北京时代北利DT5-2) 。

1.3 评价方法

按照美国临床与实验室标准化协会(CLSI)评价方案，在Luminex多功能流式点阵仪上评价本法的精密度、准确度(回归实验)、检出限，并分析本法与电化学发光法检测结果的相关性。

1.4 统计学分析

用SPSS 17.0 统计软件进行数据统计分析。t检验和回归分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 精密度验证

本实验选取上海透景肿瘤标志物质控品作为检测标本，批号180601、180602。批内选取质控品各1份，各连续测定30次。批间选取质控品个1份，连续测定30天，每天测定1次。根据变异系数公式：C·V =(标准偏差SD /平均值Mean )× 100%，计算得知CEA、CA125、CYFRA21-1及NSE的批内变异系数(CV)均<10%，批间变异系数(CV)均<13%，见表1、表2。由结果可知，4种肿瘤标志物的批内及批间变异系数均较低，表明试剂在多次重复一次测定及多次测定中均有较高的重复性，数据准确度及精密度高。

表1 流式荧光发光法精密度实验批内结果

表2 流式荧光发光法精密度实验批间结果

2.2 最低检出限的测定

检出限，是分析测定的重要指标之一，其对仪器的性能评价及方法建立都是重要的参数之一，本实验将零号校准品作为空白对照，重复测定20次，计算平均值(X)与标准差(SD),以x±2s荧光信号值时对应的指标浓度作为各指标的最低检测限。CEA、CA125、CYFRA21-1及NSE的最低检出限值分别为0.5 ng/ml，10 u/ml,1 ng/ml和2 ng/ml。

2.3 流式荧光发光法参考区间的测定

利用流式荧光发光法测定一定数量的正常临床样本(n=300)的血清CEA、CA125、CYFRA21-1及NSE的表达水平，考虑到临床检测肿瘤标志物的检测方法种类繁多，各检测方法之间略有差异，本实验根据百分位数法及结合经典文献中的推荐值，建立4种肿瘤标志物的参考区间(表3)。对检测数据进行正态性检验(Shapiro-Wilk 检验) 后，数据均呈非正态性分布。因此，采用百分位数法建立3 项肿瘤标志物的参考区间。表3所列为第95 百分位数(P95) 和第99 百分位数(P99) 的数值，以各标志物的P95作为参考区间的上限(临界值)。

表3 肿瘤标志物临床推荐参考值

2.4 不同检测方法相关性的测定

选取40例临床样本，分别采用不同检测方法对CEA、CA125、CYFRA21-1及NSE的表达水平进行检测，进行方法学比对，其线性方程如图1所示，结果列表见表4。结果显示：透景试剂盒利用流式荧光发光法检测的肿瘤标志物表达水平与罗氏电化学发光法检测出的数据相关性良好(r>0.980)。

3 讨论

本实验利用Luminex多功能流式点阵仪，将多种不同荧光编码的微球上分别以共价方式交联针对CEA、CA125、CYFRA21-1及NSE这4种肿瘤标志物的单克隆抗体，并以一定数量混合,有效地提高了临床检测效率，显著地降低了医疗成本。血清中各种肿瘤标志物会被对应的微球捕获，然后加入生物素标记的针对上述各种肿瘤标志物配对的抗体及链亲和素标记的PE混合物[10]，以形成一种抗体-肿瘤标志物抗原-生物素标记的配对抗体-链亲和素标记PE(藻红蛋白)的混合物，从而通过多功能流式点阵仪判定出肿瘤标志物的种类及浓度，具有通量高、配套试剂多、应用领域广、重复性好、既能检测蛋白质又能检测核酸等优点[11-13]。

本研究评估了流式荧光发光法检测CEA、CYFRA21-1、CA125及NSE四种肿瘤标志物的精密度，由于FFA法对每种检测指标最少进行100个微球的计数后取其平均值，从实验结果分析上相当于对每个样本额外重复了百次检测，从而保证检测结果的精密度和准确性。由结果可知，批内CV均<10%，批间CV均<13%，表明本法精密度较高。CEA、CA125、CYFRA21-1及NSE的最低检出限值分别为0.5 ng/ml，10 u/ml,1 ng/ml和2 ng/ml，提示FFA法有较好的灵敏度。作者进一步以常规健康体检患者血清水平的第95百分位数为参考区间上限，初步建立FFA法的CEA、CYFRA21-1、CA125和NSE的参考区间上限。最后，以金标准ECLIA为参考方法，通过与化学发光法比对试验得知((rCEA) = 0.98917,(rCA125) = 0.99523,(r CYFRA21-1) = 0.99978,(rNSE) =0.99059)，表明两种方法检测血清 CEA、CYFRA21-1、CA125和NSE具有较高的一致性及相关性。

综上所述，FFA检测 CEA、CYFRA21-1、CA125和NSE四种肿瘤标志物，仅需10 μl患者血清样本，45 min便可得出结果，有效地提高了临床检测效率，可广泛应用于急诊患者的快速筛查。流式荧光发光法与常规免疫分析方法相比，具有灵敏度高，精密度好，检测时间短，样本用量少，医疗成本低等优势，值得临床推广。